Homemade Site Riktad mutagenes av Whole Plasmids

Summary

Site riktad mutagenes av hela plasmider är ett enkelt sätt att skapa lite olika varianter av ett original plasmid. Här visar vi ett enkelt och kostnadseffektivt sätt att introducera basera ersättningar till en plasmid med vanliga reagenser.

Abstract

Site riktad mutagenes av hela plasmider är ett enkelt sätt att skapa lite olika varianter av ett original plasmid. Med denna metod klonade målgenen kan ändras genom substitution, radering eller införande av ett fåtal baser direkt i en plasmid. Det fungerar genom att helt enkelt förstärka det hela plasmiden, i en icke PCR-baserad termocykling reaktion. Under reaktionen mutagena grundfärger, bär den önskade mutation, är integrerade i den nyligen syntetiserade plasmiden. I denna video tutorial visar vi ett enkelt och kostnadseffektivt sätt att introducera bas substitutioner i en plasmid. Protokollet fungerar med standardreagens och är oberoende från kommersiella kit, som ofta är mycket dyra. Tillämpningen av detta protokoll kan minska den totala kostnaden för en reaktion på en åttondel av vad det kostar att använda några av de kommersiella kit. I den här videon kommenterar vi också kritiska steg under processen och ge detaljerade instruktioner om hur man konstruerar den mutagena grundfärger.

Protocol

Principen om Metod: Webbplatsen riktad mutagenes av hela plasmider förklaras i den här videon är en mutagenes metod som tillåter dig att ändra ett klonat målgenen genom substitution, radering eller införande av ett fåtal baser direkt i en plasmid. Det fungerar genom att förstärka det hela plasmiden, i en icke PCR-baserad termocykling reaktion. Under reaktionen mutagena grundfärger, bär den önskade mutation i form av obalans till den ursprungliga plasmiden, är integrerade i den ny…

Discussion

Site riktad mutagenes är en mutagenes-metod som ger ett snabbt sätt att mutera en gen som bärs av en plasmid. Hela reaktionen kan ske på endast en dag. Med denna metod måste den bara ett par gratis primer bär den önskade mutationer och en korrekturläsning polymeras som Pfu-polymeras. Den nyligen syntetiserade plasmid kan separeras från föräldrarna plasmid genom uppslutning av reaktionen med begränsningen enzymet DpnI. Detta enzym smälter bara metylerat DNA. Därför har endast den nyligen syntetiserade plas…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Pfu polymerase (recombinant or native)		fermentas	EP0571 or EP0501
dNTP mix 10 mM		fermentas	R0191
DpnI or DpnI Fast digest		fermentas	ER1701
primers		invitrogen		desalted