Bildproduktion av tät-core Blåsor i Primär Odlade hippocampus nervceller
Summary
Levande cell imaging är av särskild nytta när man studerar dynamiken i organell människohandel. Här beskriver vi ett protokoll för live avbildning av tät-core blåsor i odlade nervceller med hjälp av brett fält fluorescensmikroskopi. Detta protokoll är flexibel och kan anpassas för att bilden andra organeller som mitokondrier, endosomes och peroxisomer.
Abstract
Observera och karakterisera dynamiska cellulära processer kan ge viktig information om cellulär aktivitet som inte kan dras av statiska bilder. Vital fluorescerande prober, särskilt grönt fluorescerande protein (GFP) har revolutionerat cellbiologi härrör från förmågan att märka specifika intracellulära fack och cellstrukturer. Till exempel har den levande avbildning av GFP (och dess spektrala varianter) chimärer tillåtet för en dynamisk analys av cytoskelettet, organell transport och dynamik membran i en mängd organismer och celltyper [1-3]. Även Bildproduktion har blivit vanligare, innebär detta synsätt fortfarande många tekniska utmaningar, särskilt i grundskolor odlade nervceller. En utmaning är ett uttryck för GFP-märkta proteiner i post-mitotiska nervceller, den andra är förmågan att fånga fluorescerande bilder samtidigt minimera fototoxicitet, fotoblekning och upprätthålla allmän cell hälsa. Här ger vi ett protokoll som beskriver en lipid-baserat transfektion metod som ger en relativt låg transfektion skattesats (~ 0,5%), men är idealisk för att avbilda fullständigt polariserade nervceller. En låg transfektion är nödvändigt med så att enda axoner och dendriter kan karakteriseras som till sin läggning till cellkroppen att bekräfta riktning av transport, dvs anterograd v. retrograd. Vår syn på bildbehandling GFP uttrycka nervceller bygger på en standard brett fält fluorescerande mikroskop utrustad med en CCD-kamera, bildbehandlingsprogrammet, och en uppvärmd avbildning kammare. Vi har avbildat ett brett utbud av organeller eller strukturer, till exempel tät-core blåsor, mitokondrier, koner tillväxt och aktin utan några särskilda optiken eller krav excitation annat än en fluorescerande ljuskälla. Dessutom kan spektralt-distinkt, fluorescerande proteiner, till exempel, GFP och dsRed-märkta proteiner, visualiseras i närheten samtidigt för att karakterisera samarbete transport eller andra samordnade cellulära händelser. Den avbildningsteknik som beskrivs här är flexibel för olika bildprogram och kan antas av ett laboratorium för relativt liten kostnad som ett mikroskop är tillgänglig.
Protocol
Discussion
Levande cell imaging är en utmanande, men kraftfull teknik för direkt observation av organell transporter i odlade nervceller. Svårigheter kan uppstå före förfarandet med dålig neuron hälsa på grund av kultur komplikationer. Därför bör cell hälsa (för exempel se ref. 4) bedömas före och efter transfektion genom att observera täckglasen medan tillväxten mediet med hjälp av en vävnad mikroskop kultur ljus. Processen att överföra neuron innehåller täckglasen till avbildning kammaren kan vara stressi…
Acknowledgements
Vi tackar Harald Hutter och Helena Decker för noggrann läsning av detta manuskript. Vi tackar också Reg Sidhu från Leica Microsystems för hans tekniska kunnande. Denna forskning stöds av National Sciences and Engineering Council of Canada, Award # 327.100-06 och Simon Fraser University Faculty of Science.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine | Reagent | Mediatech | 10-010-CV | |
| Lipofectamine 2000 | Reagent | Invitrogen | 11668-027 | Transfection reagent |
| 10X Hanks with Ca2+ and Mg2+ | Reagent | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Live-imaging medium |
| 1M HEPES | Reagent | Gibco/Invitrogen | 15630-130 | Live-imaging medium |
References
- Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).
- Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon. Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).
- Barkus, R. V., et al. Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides. Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
