Dissectie van Saccharomyces Cerevisiae Asci

Summary

Micromanipulatie van de gistcellen is nodig voor de meiose genetische analyse of om diploïde zygoten te selecteren. Deze micromanipulations worden uitgevoerd met behulp van de microneedle van een dissectie microscoop. De microneedle wordt gebruikt om de cellen te verplaatsen en wordt gecontroleerd door een micromanipulator die beschikbaar zijn met een verschillende mate van automatisering.

Abstract

Gist is een zeer soepel model systeem dat wordt gebruikt om veel verschillende cellulaire processen te bestuderen. De gemeenschappelijke stam laboratorium<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Bestaat in ofwel een haploide of diploïde staat. De mogelijkheid om allelen combineren van twee haploiden en de mogelijkheid om wijzigingen aan te brengen van het genoom vergt de productie en de ontleding van ASCI. ASCI productie van haploïde cellen begint met de paring van twee gist haploïde stammen met compatibele voortplantingstypes tot een diploïde stam te produceren. Dit kan worden bereikt op een aantal manieren, hetzij op vast medium of in de vloeistof. Is het voordelig om te kiezen voor de diploïden in medium dat selectief hun groei bevordert ten opzichte van een van de haploïde stammen. De diploïden worden dan toegestaan ​​om sporulate op voedselarme medium om ASCI, een bundel van vier haploïde dochtercellen als gevolg van meiotische reproductie van de diploïde vorm. Een mengsel van vegetatieve cellen en asci wordt vervolgens behandeld met het enzym zymolyase te verteren weg het membraan zak rond de ascosporen van de ASCI. Met behulp van micromanipulatie met een microneedle onder een microscoop een dissectie kan ophalen individuele ASCI en aparte en verplaats de vier ascopores. ASCI ontleed worden gekweekt voor meerdere dagen en getest voor de markers of allelen van een belang door replica uitplaten op geschikte selectieve media.

Protocol

Bouw van diploïde stammen Protocol voor de productie van diploïden door voortplanting De initiële stammen moeten worden geslagen op YPD, of selectief medium, indien nodig, om enkele kolonies te produceren. De twee haploïde stammen moeten zijn van tegengestelde mating type (dwz Mata en MATα). Met behulp van een steriele enting lus kies een klein deel van een kolonie van een van de twee haploïde stammen. Op een nieuwe plaat YPD streep de lus een keer in een rechte lijn over de plaat. Mark…

Discussion

Gist dissectie is een nuttig instrument om nieuwe stammen te selecteren met de gewenste markers. Bij het bepalen van de theoretische groeipatroon van vier ascosporen is het belangrijk om te kijken naar het genotype van het vegetatieve cel. Als er een plasmide aanwezig is, moet men weten of het is single, laag of hoog te kopiëren, omdat dit zal invloed hebben op die ascospore (s) het plasmide ontvangen en zullen van invloed zijn voorspellingen en de conclusies ten aanzien van de stammen wordt gemanipuleerd.

<p class…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Singer MSM System 200	Microscope	Singer Instruments	NA
D-sorbitol	Reagent	BioShop	SOR508
Tris	Reagent	BioShop	TRS001
Zymolyase 100T	Reagent	Seikagaku Corporation	120493
Yeast extract	Reagent	BioShop	YEX401
Peptone	Reagent	BioShop	PEP 403
D-glucose	Reagent	BioShop	GLU501
Yeast nitrogen base	Reagent	BioShop	YNB406
Bio-tryptone	Reagent	BioShop	TRP402
Sodium chloride	Reagent	BioShop	SOD002
Potassium acetate	Reagent	BioShop	POA 301
Agar	Reagent	BioShop	AGR003
Adenine sulfate	Reagent	BioShop	ADS201
L-uracil	Reagent	BioShop	URA 241
L-tryptophan	Reagent	BioShop	TRP 100
L-histidine	Reagent	BioShop	HIS 200
L-arginine	Reagent	Amresco	0877-100G
L-methionine	Reagent	BioShop	MET 222
L-tyrosine	Reagent	BioShop	TYR 333
L-isoleucine	Reagent	BioShop	ISO 910
L-valine	Reagent	BioShop	VAL 201
L-lysine	Reagent	BioShop	LYS 101
L-phenylalanine	Reagent	BioShop	PHA 302
L-glutamic acid	Reagent	BioShop	GLU 202
L-threonine	Reagent	BioShop	THR002
L-leucine	Reagent	BioShop	LEU 222