المستضد CD4 + تصور معين باستخدام خلايا T MHC الدرجة الثانية Tetramers
Summary
هذا الإجراء يدل على تنقية والتوسع في المختبر من خلايا CD4 + محددة مستضد الخلايا التائية من الدم المحيطي كله والتصور وذلك باستخدام MHC tetramers الطبقة الثانية Tetramers تسمح التصور المباشر للخلايا T مع خصوصية واحدة ومحددة مستضد MHC تقييد الدرجة الثانية.
Abstract
معقد التوافق النسيجي الكبير (MHC) من الدرجة الثانية tetramers سماح التصور المباشر لمستضد معين CD4 + الخلايا التائية التي التدفق الخلوي. هذا الأسلوب يعتمد على التفاعل بين الببتيد محددة للغاية ومحملة MHC المقابلة مستقبلات الخلايا تي. في حين أن تقارب من جزيء MHC / الببتيد واحدة منخفضة ، عبر ربط مجمعات MHC / الببتيد مع streptavidin يزيد الطمع من التفاعل ، مما يتيح استخدامها في تلوين الكواشف. بسبب الترددات المنخفضة نسبيا من خلايا CD4 + T (~ 1 في 300000 لخصوصية واحدة) هذا الاختبار يستخدم لتضخيم المختبر في خطوة لزيادة عتبة الخمسين من الكشف. وتنقيته من الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى التي تقوم عليها Ficoll. ثم يتم فصل خلايا CD4 + عن طريق الانتقاء السلبي باستخدام biotinylated كوكتيل الأجسام المضادة والمعادية للالبيوتين المسمى الخرز المغناطيسي. استخدام خلايا ملتصق من الكسر خلايا CD4 كما مستضد تقديم الخلايا ، CD4 + T يتم توسيع الخلايا في وسائل الإعلام عن طريق إضافة الببتيد مستضدي وايل – 2. هي ملطخة الخلايا موسعة مع tetramer الدرجة الثانية المقابلة التي يحتضنها عند 37 مئوية لمدة ساعة واحدة وملون في وقت لاحق باستخدام الأجسام المضادة السطحية مثل CD4 المضادة ، ومكافحة CD3 ، ومكافحة CD25. بعد وضع العلامات ، ويمكن تحليل الخلايا مباشرة من التدفق الخلوي. الخلايا tetramer شكل إيجابي عادة سكانية متميزة بين CD4 + توسيع الخلايا. خلايا Tetramer ايجابية وعادة ما تكون CD25 + CD4 ، وارتفاع في أغلب الأحيان. لأن مستوى تلطيخ tetramer الخلفية يمكن أن تختلف ، ينبغي دائما أن تكون النتائج ايجابية تلطيخ مقارنة تلطيخ الخلايا نفسها مع tetramer غير ذي صلة. اختلافات متعددة من هذا الاختبار الأساسية ممكنة. ويمكن فرز الخلايا Tetramer إيجابية لمزيد من التحليل المظهري ، أو إدراجها في ELISPOT المقايسات انتشار الأسلحة النووية ، أو فحوصات ثانوية أخرى. وقد أثبتت عدة مجموعات كما شارك في تلطيخ tetramers به وإما لمكافحة خلوى أو أضداد FoxP3.
Protocol
Discussion
فهم دور خلايا CD4 + T في الحصانة من المهم بشكل أساسي. ومع ذلك ، يمكن CD4 + محددة مستضد الخلايا التائية يكون من الصعب اكتشاف وعزل باستخدام الطرق التقليدية. في المقابل ، MHC الدرجة الثانية tetramers سماح التصور المباشر لخلايا CD4 + T مع خصوصية المستضد المطلوب. هذا الفيديو يدل على العز…
Acknowledgements
نشكر ديك فولي وكيمبال لي لدورهم الرئيسي في تصوير وإنتاج أشرطة الفيديو.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Class 2 Laminar flow biosafety cabinet | equipment | Thermo Forma | 1200 | Or equivalent |
| 50 mL conical Tube | equipment | VWR | 47747-182 | Or equivalent |
| 1X PBS (Ca/Mg free) | Reagent | HyClone | SH30028.02 | Or equivalent |
| Ficoll-paque PLUS | Reagent | GE Healthcare | 17-1440-03 | foil wrapped to protect from light |
| Pipet Aid XP | equipment | Drummond | 4-000-101 | Or equivalent |
| 10 mL pipet | equipment | Corning/Costar | CLS4492 | Or equivalent |
| Aerosolve Canisters | equipment | Beckman | 359481 | with 50 mL inserts |
| Centrifuge | equipment | Beckman | GS-6R | Or equivalent |
| Transfer pipets | equipment | Samco | 202-20S | Or equivalent |
| Pasteur pipets | equipment | VWR | 14672-200 | Or equivalent |
| Hemolytic Buffer | Reagent | N/A | N/A | 8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA |
| Trypan blue | Reagent | Sigma | T6146 | 0.2% in PBS |
| Hemocytometer | equipment | VWR | 15170-208 | |
| 15 mL conical tube | equipment | VWR | 05-527-90 | Or equivalent |
| Running Buffer | Reagent | N/A | N/A | PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA |
| MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | Or equivalent |
| EasySep® Magnet | equipment | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| 5 mL polypropylene tube | equipment | Falcon | 352063 | |
| RPMI 1640 | Reagent | Invitrogen | 22400-089 | with 25 mM HEPES |
| Pooled human serum | Reagent | N/A | N/A | drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered |
| Pen Strep | Reagent | Invitrogen | 1570-063 | Or equivalent |
| 500mL 0.22 micron bottle top filter | equipment | Nalgene | 595-3320 | Or equivalent |
| 48-well plate | equipment | Costar | 3548 | Or equivalent |
| 37°C CO2 incubator | equipment | Sanyo Scientific | MCO-18AIC | Or equivalent |
| 20 mg/mL synthetic peptide | Reagent | N/A | N/A | Custom synthesis from any peptide vendor |
| 5 mL FACS tube | equipment | Falcon | 352008 | Polystyrene |
| Peptide loaded class II tetramer (as described) | Reagent | N/A | N/A | Prepared by the BRI tetramer core |
| Anti-CD3 | Reagent | BD pharmingen | 347344 | Or equivalent |
| Anti-CD4 | Reagent | eBioscience | 17-0049-73 | Or equivalent |
| Anti-CD25 | Reagent | eBioscience | 11-0259-73 | Or equivalent |
| Facs Calibur Flow Cytometer | equipment | BD Biosciences | 342975 | Or equivalent |
References
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen. J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens. J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).
