Visualizando CD4 + antígeno específico Células T usando MHC Classe II tetrâmeros

Summary

Este procedimento demonstra a purificação e expansão in vitro de células CD4 + antígeno específico das células T do sangue periférico todo e sua visualização usando tetrâmeros de MHC classe II. Tetrâmeros permitir a visualização direta das células T com uma especificidade antígeno único e definido MHC classe II restrição.

Abstract

Complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe II tetrâmeros permite a visualização direta do antígeno específico CD4 + células T por citometria de fluxo. Esse método se baseia na interação altamente específica entre peptídeo carregado MHC eo receptor de células T correspondente. Enquanto a afinidade de uma molécula MHC / peptídeo única é baixa, cross-linking complexos MHC / peptídeo com estreptavidina aumenta a avidez da interação, possibilitando a sua utilização como coloração reagentes. Por causa das freqüências relativamente baixas de células CD4 + T (~ 1 em 300.000 para uma especificidade única) este ensaio utiliza um passo de amplificação in vitro para aumentar o seu limiar de detecção. Células mononucleares são purificadas do sangue periférico por underlay Ficoll. CD4 + células são então separados por seleção negativa usando cocktail anticorpo biotinilado e anti-biotina marcada esferas magnéticas. Usando células aderentes a partir da fração de células CD4-células apresentadoras de antígenos como, células T CD4 + são expandidos em mídia pela adição de um peptídeo antigênico e IL-2. As células expandidas estão manchadas com o correspondente da classe II tetrâmero pela incubação a 37 C por uma hora e, posteriormente, coradas anticorpos de superfície, como anti-CD4, anti-CD3 e anti-CD25. Após a marcação, as células podem ser diretamente analisados ​​por citometria de fluxo. As células positivas tetrâmero normalmente formam uma população distinta entre os CD4 + células expandidas. Tetrâmero células positivas são geralmente CD25 + CD4 e, muitas vezes elevados. Porque o nível de coloração tetrâmero fundo pode variar, os resultados da coloração positiva deve ser sempre comparado com a coloração das células mesmo com um tetrâmero irrelevante. Múltiplas variações deste ensaio básicas são possíveis. Tetrâmero células positivas podem ser classificadas para a análise fenotípica ainda, a inclusão no ELISPOT ou ensaios de proliferação, ou outros ensaios secundários. Vários grupos também demonstraram co-coloração usando tetrâmeros e ou de citocinas anti-ou anti-FoxP3 anticorpos.

Protocol

1. Do sangue periférico mononuclear cela de isolamento (PBMC) Obter uma amostra de sangue – sangue deve ser coletado em seringas ou tubos de sangue e anti-coagulado com heparina (1:50 ratio) para prevenir a coagulação. Esperar um rendimento de cerca de 1 × 10 6 PBMC por mL de sangue – cerca de 40% dos quais serão CD4 positivos (CD4 +) células T. Alíquota do sangue em tubos cônicos de 50 mL, 25 mL por tubo. Se o sangue tem separado, misture suavemente antes de alíquotas para distr…

Discussion

Compreensão do papel das células T CD4 + na imunidade é de fundamental importância. No entanto, CD4 + antígeno específico das células T pode ser difícil de detectar e isolar usando métodos tradicionais. Em contraste, tetrâmeros de MHC classe II permite a visualização direta de células CD4 + T com a especificidade do antígeno desejado. Este vídeo demonstra o isolamento, purificação e amplificação in vitro de células CD4 + T e sua visualização posterior usando tetrâmeros. Tetrâmeros de classe II s?…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Class 2 Laminar flow biosafety cabinet	equipment	Thermo Forma	1200	Or equivalent
50 mL conical Tube	equipment	VWR	47747-182	Or equivalent
1X PBS (Ca/Mg free)	Reagent	HyClone	SH30028.02	Or equivalent
Ficoll-paque PLUS	Reagent	GE Healthcare	17-1440-03	foil wrapped to protect from light
Pipet Aid XP	equipment	Drummond	4-000-101	Or equivalent
10 mL pipet	equipment	Corning/Costar	CLS4492	Or equivalent
Aerosolve Canisters	equipment	Beckman	359481	with 50 mL inserts
Centrifuge	equipment	Beckman	GS-6R	Or equivalent
Transfer pipets	equipment	Samco	202-20S	Or equivalent
Pasteur pipets	equipment	VWR	14672-200	Or equivalent
Hemolytic Buffer	Reagent	N/A	N/A	8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA
Trypan blue	Reagent	Sigma	T6146	0.2% in PBS
Hemocytometer	equipment	VWR	15170-208
15 mL conical tube	equipment	VWR	05-527-90	Or equivalent
Running Buffer	Reagent	N/A	N/A	PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA
MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II	Reagent	Miltenyi Biotec	130-091-155	Or equivalent
EasySep® Magnet	equipment	Stem Cell Technologies	18000
5 mL polypropylene tube	equipment	Falcon	352063
RPMI 1640	Reagent	Invitrogen	22400-089	with 25 mM HEPES
Pooled human serum	Reagent	N/A	N/A	drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered
Pen Strep	Reagent	Invitrogen	1570-063	Or equivalent
500mL 0.22 micron bottle top filter	equipment	Nalgene	595-3320	Or equivalent
48-well plate	equipment	Costar	3548	Or equivalent
37°C CO2 incubator	equipment	Sanyo Scientific	MCO-18AIC	Or equivalent
20 mg/mL synthetic peptide	Reagent	N/A	N/A	Custom synthesis from any peptide vendor
5 mL FACS tube	equipment	Falcon	352008	Polystyrene
Peptide loaded class II tetramer (as described)	Reagent	N/A	N/A	Prepared by the BRI tetramer core
Anti-CD3	Reagent	BD pharmingen	347344	Or equivalent
Anti-CD4	Reagent	eBioscience	17-0049-73	Or equivalent
Anti-CD25	Reagent	eBioscience	11-0259-73	Or equivalent
Facs Calibur Flow Cytometer	equipment	BD Biosciences	342975	Or equivalent