Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. Part 1 3.
Abstract
Aile<em> Poxviridae</em> Sadece enfekte hücrelerin sitoplazmasında çoğaltmak virüsler içeren büyük çift iplikli DNA oluşur. Üyeleri<em> Orthopox</em> Cinsine dahil variola, insan küçük çiçeği etkeni, monkeypox ve vaccinia (VAC), virüs aile prototipik üyesi. Göreceli olarak büyük (~ 200 kb) vaccinia genom içinde gen üç sınıfa kodlanır: erken, orta ve geç. Her üç sınıf, viral kodlanmış RNA polimeraz tarafından transkripsiyonu olsa da, her sınıf, virüsün yaşam döngüsü içinde farklı bir fonksiyon sunar. Poxviruses enfeksiyon sırasında ev sahibi hücresel ortamı modülasyonu için çoklu stratejiler kullanmaktadır. Hem ev sahibi hem virüs gen ekspresyonu düzenlenmesi anlamak için, biz, hem virüs ve konak hücrelerine transkript bolluk analiz etmek için genom yaklaşımlar kullanılmaktadır. Burada, birkaç saat sonrası enfeksiyon Vaccinia virüs ve örnekleme RNA HeLa hücrelerinde zaman ders enfeksiyonları göstermektedir. Her iki konak ve viral toplam RNA gen ekspresyonu analizi için mikroarray'ler hibridizasyon için izole edilmiş ve yükseltilir.
Protocol
Bölüm 1: enfeksiyon ayarlama Matara HeLa hücreleri büyümek ve hücrelerin yaklaşık% 80 konfluent kadar bekleyin. % 2 FBS ile düzenli DMEM ve ilavesiz antibiyotikler: deney için yeterli viral büyüme ortamı hazırlayın. Enfeksiyon ya ham vaccinia virüs bilinen bir titreye sahip hisse senedi, ya da ev sahibi gen ekspresyonu ile ilgili endişeleriniz varsa, bilinen bir titreye sahip virüs saflaştırılmış sakaroz ile yapılabilir. Doğrudan devam, sakaroz saflaştı…
Discussion
Kritik Adımlar
Part 1 & 2
Senkron vaccinia enfeksiyonu kurma pek çok kritik adımlar vardır, virüsün ilk olmanın dikkatli sonication (veya trypzinizing), virüs parçacıkları parçalara ayırma için. Vaccinia toplayarak için son derece eğilimli ve virüs parçacıkları bozulması hücre bile enfeksiyon sağlamak için önemlidir. Senkron bir enfeksiyon ulaşmak için (2'den fazla), İçişleri Bakanlığı, her bir hücre enfekte yüksek sağlamak …
Acknowledgements
Whitehead Enstitüsü'nden Fellows Fonları
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
TRIzol Reagent
Reagent
Invitrogen
15596-026
Similar reagents, such as TriPure from Roche, will also work.
Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1. J. Vis. Exp. (26), e1168, doi:10.3791/1168 (2009).