Um método de alto rendimento para estudar a morfologia global organela em S. cerevisiae

Resumo

GFP-fusão proteínas são amplamente utilizados para visualizar organelas por microscopia confocal. No entanto, a triagem para mutações que afetam a morfologia das organelas geralmente requer mutagênese individual e é demorado. Aqui, nós demonstramos um método para incorporar simultaneamente organela-GFP marcadores em quase 5.000 genes não-essenciais no fermento.

Resumo

Alto rendimento métodos para examinar localização de proteínas ou morfologia organela é uma ferramenta eficaz para o estudo de interações de proteínas e podem ajudar a alcançar uma compreensão abrangente de vias moleculares. Em Saccharomyces cerevisiae, com o desenvolvimento da matriz de exclusão não essenciais gene, podemos globalmente estudar a morfologia das organelas diferentes, como o retículo endoplasmático (ER) e da mitocôndria utilizando GFP (ou variante) marcadores no gene backgrounds diferentes. No entanto, os marcadores de GFP incorporando em cada mutante único individualmente é um processo trabalhoso. Aqui, descrevemos um procedimento que é utilizado rotineiramente em nosso laboratório. Usando um sistema robótico para lidar com arrays de alta densidade fermento e técnicas de seleção de drogas, podemos reduzir significativamente o tempo necessário e melhorar a reprodutibilidade. Em resumo, nós cruzamos um marcador GFP-tagged mitocondrial (Apc1-GFP) para um conjunto de alta densidade de 4.672 mutantes de deleção do gene não essencial por robótico réplica pinagem. Através da seleção diplóide, esporulação, germinação e seleção marcador dual, nós recuperamos ambos os alelos. Como resultado, cada mutante haplóide única contém Apc1 GFP-incorporados em seu locus genômica. Agora, podemos estudar a morfologia das mitocôndrias em todas fundo não essenciais mutante. Usando essa abordagem de alto rendimento, podemos convenientemente estudar e delinear os caminhos e os genes envolvidos na herança ea formação de organelas em um cenário de todo o genoma.

Protocolo

Materiais e métodos:

1. Cepas de leveduras:
   • ACP1-GFP (GFP:: Seu): C-terminal GFP-tagging de ACP1 foi gerado por uma PCR mediada por recombinação homóloga usando pKT128 plasmídeo (contém GFP e HIS5). Transformantes positivos foram confirmados por microscopia confocal e colônia PCR. O pano de fundo a tensão foi BY7043 (MAT alfa can1Δ:: STE2pr-lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0) de Boone laboratório (Tong e Boone, 2006).
   • Exclusão da Matriz Mutant (DMA) (xxx:: KanR): é um conjunto de cerca de 5.000 mutantes de deleção de genes não-essenciais. Todos estes genes não-essenciais foram eliminados na G418. O pano de fundo a tensão da ma....

Discussão

Este método pode ajudar eficientemente incorporar um marcador mitocondrial, ACP1-GFP em várias formações mutantes. Ele se baseia na utilização de um sistema robótico, e pode facilmente adotado para uso com qualquer sistema robótico. Este procedimento pode ser usado também para incorporar outros tipos de marcadores. Por exemplo, para visualizar ER, que utilizam rotineiramente o marcador Erg11-GFP. No nosso imagens representativas, uma mutante e um tipo selvagem com o fabricante ACP1-GFP foram visualiz ed por microscopia .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Mídia SGA			A mídia de crescimento (YPD) e as mídias sintéticas de eliminação (SD), incluindo LRK e LHRK, e a mídia enriquecida para esporulação utilizadas neste protocolo são comumente empregadas na biologia molecular de leveduras. Consulte Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) para descrições detalhadas.