Идентификация белковых комплексов с количественной протеомики в CEREVISIAE С.
Summary
Здесь мы опишем новые количественные техники протеомики для идентификации белковых комплексов в CEREVISIAE Saccharomyces. В данном исследовании мы использовали метод SILAC вместе с аффинной очистки следует тандемной масс-спектрометрии для определения с высокой специфичностью обязательными партнерами ER белков, Scs2p.
Abstract
Липиды являются строительным материалом клеточных мембран, которые функционируют как барьеров и дробления клеточных процессов, а в последнее время, в качестве важных внутриклеточных сигнальных молекул. Однако, в отличие от белков, липидов небольшие гидрофобные молекулы, что трафик прежде всего плохо описываются nonvesicular маршрутов, которые предположили, происходит на мембранных контактов сайтов (СМКС). СМКС регионы, где эндоплазматический ретикулум (ER) делает прямого физического контакта с партнерских органелл, например, плазматической мембраны (ПМ). ER часть ЭР-ПМ СМКС обогащается липидами синтеза ферментов, предполагая, что синтез липидов направлена на эти сайты и подразумевая, что СМКС важны для липидной трафика. Дрожжи идеальной моделью для изучения ЭР-ПМ СМКС из-за их изобилия, с более чем 1000 контактов в клетке, и их сохранения природы во всех эукариот. Раскрытие белки, которые составляют СМКС имеет решающее значение для понимания того, как липиды трафика осуществляется в клетках, и как они действуют в качестве сигнальных молекул. Мы обнаружили, что ER называется Scs2p локализовать к ER-ПМ СМКС и имеет важное значение для их формирования. Мы ориентированы на выявление молекулярно партнеров Scs2p. Идентификация белковых комплексов традиционно основывается на решении первой очищенных образцов белка помощью гель-электрофореза, а затем в-гель переваривание белка полосы и анализа пептидов, масс-спектрометрии. Это часто ограничивает исследования небольшой группы белков. Кроме того, белковые комплексы подвергаются денатурации или не-физиологических условиях во время процедуры. Чтобы обойти эти проблемы, мы осуществили крупномасштабные количественные техники протеомики для извлечения объективной и количественных данных. Мы используем стабильные маркировки изотопа с аминокислотами в культуре клеток (SILAC) включить основных ядер изотопа в белки в немаркированные напряжение управления. Равные объемы меченых культуры и немаркированные, SILAC меченных культуры смешиваются и лизированных путем измельчения в жидком азоте. Затем проводят процедуры аффинной очистки снести белковых комплексов. Наконец, мы осадок белка образца, который готов для анализа высокопроизводительной жидкостной хроматографии / тандемной масс-спектрометрии. Самое главное, белки контрольного штамма помечены тяжелого изотопа и будет производить масса / заряд сдвиг, который может быть определена количественно против немеченого белков в приманку напряжения. Таким образом, загрязнители, или неспецифических связывание может быть легко устранена. Используя этот подход, мы выделили несколько белков, роман, который локализуется ЭР-ПМ СМКС. Здесь мы приводим подробное описание нашего подхода.
Protocol
Discussion
Аликвоты сохраняются при очистке процедуры должны включать в себя (1) предварительно очищен Клеточный лизат, (2) связанной фракции, (3) несвязанные фракции, и (4) элюировали фракцию. Мы рекомендуем проанализировать содержание белка выше аликвоты западных промокательной с использованием а…
References
- Loewen, C. J. Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization. Jour. Cell Biol. 179, 467-483 .
- Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 .
- Puig, O. The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 .
- Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics. , 123-125 .
