Cella di misura Estensione impianto a parete (Creep), indotta dal pH acido e da Alpha-espansina

Summary

Dimostriamo l'uso di un estensimetro a forza costante per misurare la estensione a lungo termine (creep) di campioni di cellule vegetali muro indotta da buffer acidi e proteine ​​espansina.

Abstract

Crescente pareti delle cellule vegetali tipicamente mostrano una proprietà conosciuta come 'la crescita acido', con la quale si intende che sono più estensibili a pH basso (<5) ^1. L'ormone vegetale auxina stimola l'allungamento delle cellule in rapida steli giovani e tessuti simili, almeno in parte da un acido-crescita meccanismo ^{2, 3.} Auxina attiva una pompa H ⁺ nella membrana plasmatica, che causano l'acidificazione della soluzione di parete cellulare. Acidificazione muro attiva espansine, che sono endogeni-allentamento della parete cellulare delle proteine ^​​4, causando la parete cellulare di cedere alle tensioni muro creato dalla pressione di turgore delle cellule. Come risultato, la cellula comincia a ingrandire rapidamente. Questo fenomeno di 'crescita acido' è facilmente misurata in campioni di cellule isolate (non vivente) muro. La capacità delle pareti delle cellule di sottoporsi acido-indotta estensione non è semplicemente il risultato della sistemazione strutturale di polisaccaridi della parete della cella (pectine ad esempio), ma dipende dall'attività di espansine ^5. Espansine non hanno conosciuto alcuna attività enzimatica e l'unico modo di saggiare per l'attività espansina è quello di misurare la loro induzione di estensione della parete cellulare. Questa relazione Dettagli video le fonti e tecniche di preparazione per l'ottenimento di Pareti di materiali idonei per saggi espansina e continua a mostrare acido-indotta estensione e espansina indotta estensione dei campioni parete preparata da hypocotyls cetriolo in crescita.

Per ottenere campioni idonei parete cellulare, cetriolo piantine sono cresciute al buio, la hypocotyls sono tagliati e congelati a -80 ° C. Hypocotyls congelati sono abrase, appiattito, e poi bloccato a tensione costante in una cuvetta speciale per misure estensimetro. Per misurare l'acido-indotta estensione, le pareti sono inizialmente tamponato a pH neutro, con conseguente bassa attività di espansine che sono componenti delle pareti cellulari native. Al cambio di buffer a pH acido, espansine sono attivate e le pareti cellulari estendere rapidamente. Abbiamo anche mostrato attività espansina in un test di ricostituzione. Per questa parte, usiamo un breve trattamento termico a denaturare le espansine nativo nei campioni di parete cellulare. Queste pareti cellulari inattivato non si estendono anche in tampone acido, ma aggiunta di espansine alle pareti delle cellule ristabilisce rapidamente la loro capacità di estendere.

Protocol

Parte 1: Crescere e stoccaggio di materiale vegetale idoneo Nella nostra esperienza, hypocotyls giovani piantine di cetriolo eziolata servire come comoda fonte di materiale della parete cellulare per questi esperimenti. Semi di cetriolo vengono seminati su carta bagnata in un box a prova di luce, che è conservato in un armadio buio in un ambiente a temperatura costante di 26 ° C. La temperatura esatta non è critica, come qualcosa tra i 22 ° e 30 ° C dovrebbe andare bene, ma la temperatura a determinare l…

Discussion

Per questa dimostrazione abbiamo usato le pareti delle cellule da hypocotyls cetriolo perché hanno dimostrato di essere una fonte affidabile di campioni di muro che sono facili da maneggiare e che rispondono con una buona sensibilità. Abbiamo anche avuto un buon successo con le pareti di altre piantine così come alcuni materiali dal supermercato, come foglie di spinaci giovani e gambi di sedano. In sostanza, giovane, morbido, tessuti vegetali in rapida crescita sono suscettibili di essere facilmente misurato con ques…