在本视频中，我们演示如何利用全内反射荧光（TIRF）显微镜对金鱼视网膜双极细胞中单个突触小泡的胞吐及转运过程进行标记与可视化观察。
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本文内容
摘要
摘要
全内反射荧光（TIRF）显微镜技术通过选择性成像靠近高折射率物质（如玻璃）的荧光分子，实现对细胞膜上发生的事件进行研究1. 在本文中，我们将该技术应用于成像从金鱼视网膜分离的视网膜双极细胞中突触小泡的胞吐作用。由于这些神经元具有较大的轴突终末，非常适合此类研究。通过同时对双极细胞进行膜片钳记录，可以研究突触前膜电位与突触释放之间的关系2,3. 通过共喷施染料和含有高浓度 K⁺ 的任氏液，将荧光染料（FM 1-43®）加载至双极细胞终末内的突触小泡中+浓度聚集到突触末梢，从而去极化细胞并刺激内吞作用，使染料随之进入谷氨酸能囊泡。在洗去多余染料约30分钟后，细胞即可用于同时进行膜片钳记录和488 nm激光成像。膜片电极内液含有基于罗丹明的肽段，该肽段可特异性结合突触带蛋白RIBEYE。4，从而在使用 561 nm 激光对终末进行成像时特异性地标记突触带。这使得能够精确定位活性区，并区分突触内与突触外事件。
方案
第一部分：解剖与双极细胞分离
- 配制表2中列出的溶液；用NaOH将任氏液（外部）溶液的pH值调节至7.4，用CsOH将内部溶液的pH值调节至7.2；用铝箔包裹内部溶液以避光，并在4 °C下保存至使用；
- 在解剖前，将金鱼在暗处适应至少30分钟；
- 在动物暗适应期间，准备5 mL透明质酸酶溶液（V型透明质酸酶，1100单位/mL，溶于低Ca2+任氏液；Sigma，St. Louis，MO）和10 mL L-半胱氨酸溶液（0.5 mg/mL，溶于低Ca2+任氏液），并称取木瓜蛋白酶（冻干粉末，40单位/mL；Sigma，St. Louis，MO）用于配制5 mL消化液；
- 使用手术剪迅速断头处死金鱼，并用#11手术刀片破坏脑和脊髓；
- 使用#7弯头Dumont镊子破坏眼外肌，并用虹膜剪剪断视神经，以摘除眼球；
- 将一只眼球置于滤纸上，用#11手术刀片尖端刺穿巩膜缘；
- 将Vannas剪刀的刀片插入穿刺孔内，剪除整个前节部分；
- 将一小片滤纸置于剩余的视杯上方，施加一定压力，使滤纸吸收玻璃体液；
- 提起附有视网膜的滤纸，用Vannas剪刀剪断视神经；
- 将带有视网膜的滤纸放入盛有透明质酸酶溶液的35 mm塑料培养皿中，并借助#7 Dumont镊子将视网膜从滤纸上剥离；
- 使用工业碳素钢单刃刀片的一半将视网膜切成4–....
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讨论
物镜型全内反射荧光显微镜的优点包括：1）通过将激发光限制在物镜焦平面内的狭窄区域，实现优异的光学切片能力，从而最大限度地减少非焦平面光线的干扰；2）由于光强随距离呈指数衰减，因此可通过荧光强度的变化来监测垂直方向上的运动；3）利用高数值孔径物镜高效收集光线1,5。
该技术的主要缺点是仅限于成像发生在100微米以内的事件& 细胞表面的纳米级结构，这大致相当于透射电镜中的超薄切片。因此，这些事件的可视化在很大程度上依赖于细胞牢固地贴附在玻璃表面、突触带接近贴附于玻璃的膜区域以及囊泡的成功加载。本方案仅能实现双极细胞突触终末中总囊泡数量的1–2%被成功加载。2,6需要指出的是，细胞表面实际发生的事件远比我们能够成像的要多得多。
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致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 EY 14990 支持。
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参考文献
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones. Nature. 406, 849-854 (2000).<....
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