JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

הקלטה של ​​אלקטרו תסיסנית עובריים

Published: May 21, 2009
doi:
10.3791/1348
, ,
1Department of Biological Sciences,University of Illinois, 2Department of Biological Sciences,Vanderbilt University

Summary

הקלטות אלקטרו מן<em> תסיסנית</em> עוברים לאפשר ניתוח של שריר בפיתוח תכונות הנוירון חשמל, כמו גם אפיון של synaptogenesis תפקודית בצומת neuromuscular glutamatergic ו כולינרגית מרכזית וסינפסות GABAergic.

Abstract

תסיסנית הוא מודל גנטי המוביל במחקר של פיתוח הן עובריים המוח תפקודית. באופן מסורתי, בתחומים אלה הם די מבודדים אחד מהשני, עם היסטוריה עצמאית במידה רבה קהילות מדעיות. עם זאת, הממשק בין שדות אלה נבדלים בדרך כלל התוכניות התפתחותית תפקודית הבסיסית רכישת נכסים איתות חשמלי הבחנה של סינפסות כימיות תפקודית במהלך השלבים האחרונים של הקמת מעגל עצבי. ממשק זה הוא אזור חשוב ביותר לחקירה. ב תסיסנית, אלה שלבים של התפתחות תפקודי להתרחש בתקופה של <8 שעות (במהירות של 25 ° C) במהלך השליש האחרון של העובר. תקופה זו התפתחותי מאוחר נחשב ארוך סורר אל בשל חקירה בתצהיר של הציפורן, קשה אפידרמיס חדיר. מראש היה פריצת דרך ביישום של דבק מים polymerizing כירורגית כי ניתן להחיל באופן מקומי כדי לאפשר לציפורן לנתיחה מבוקר של עוברים בשלב מאוחר. עם חתך אורכי הגבי, העובר יכול להיות מונח שטוח, חשיפת עצבים בחוט הגחון ועל קיר שרירי הגוף חקירה ניסויית. Whole-cell-clamp תיקון טכניקות אז יכול להיות מועסק על מנת להקליט בנפרד נוירונים לזיהוי והשרירים סומטי. תצורות אלו הקלטה שימשו כדי לעקוב אחר המראה ההבשלה של זרמים יוניים התפשטות פוטנציאל פעולה בשני הנוירונים והשרירים. מוטנטים גנטיים המשפיעים אלה התכונות החשמליות כבר מאופיין לחשוף את ההרכב המולקולרי של תעלות יונים ומתחמים איתות קשור, ולהתחיל חקר המנגנונים המולקולריים של בידול פונקציונלי. דגש מיוחד כבר את הרכבה של קשרים סינפטיים, הן בפריפריה מערכת העצבים המרכזית. Glutamatergic neuromuscular צומת (NMJ) נגיש ביותר שילוב של דימות אופטי ורישום אלקטרו. אלקטרודה יניקה כוס משמש כדי לעורר את העצבים ההיקפית, עם הגירוי הנוכחי לצומת (EJC) הקלטות שנעשו בשריר מתח מהודק. תצורה זו הקלטה שימש בתרשים בידול פונקציונלי של הסינפסה, ולעקוב אחר המראה ההבשלה של נכסים presynaptic שחרור גלוטמט. בנוסף, תכונות postsynaptic ניתן assayed באופן עצמאי באמצעות iontophoretic או יישום בלחץ של גלוטמט ישירות על פני שרירים, כדי למדוד את המראה ואת ההבשלה של שדות קולטן הגלוטמט. לפיכך, גם אלמנטים טרום postsynaptic ניתן לנטר בנפרד או בשילוב במהלך synaptogenesis עובריים. מערכת זו הייתה בשימוש רב לבודד ולאפיין מוטציות גנטיות הפוגעות במבנה סינפסה העוברית, וכך לגלות את המנגנונים המולקולריים השולטים מפרט והבחנה של קשרים סינפסה ופונקציונלי תכונות האיתות הסינפטי.

Protocol

חלק 1: ציוד ואספקה הקלטה אלקטרו מעוברים תסיסנית הראשונה מחייבת מיומנות בטכניקות לנתיחה עובריים, אשר מתוארים וידאו אחר יופיטר. הקלטה אלקטרו מעוברים תסיסנית מנצל תקן מהדק תיקון תצו?…

Discussion

הקלטה אלקטרו מעוברים תסיסנית דורש מניפולציה דיסקציה ידנית. הבריאות של התכשיר, ואיכות הסוגר של הקלטות, תלוי על אחד להיות מסוגל במהירות בצורה מסודרת להכין את הרקמות עובריים שביר הקלטה, ולאחר מכן לבצע את הניסוי. הניסויים צריכים להיות בקיאים בשני חתכים עובריים מהדק…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

KB הוא נתמך על ידי NIH מענק GM54544.

References

  1. Aravamudan, B., Fergestad, T., Davis, W. S., Rodesch, C. K., Broadie, K. Drosophila UNC-13 is essential for synaptic transmission. Nat. Neurosci. 2, 965-971 (1999).
  2. Auld, V. J., Fetter, R. D., Broadie, K., Goodman, C. S. Gliotactin a novel transmembrane protein on peripheral glia, is required to form the blood-nerve barrier in Drosophila. Cell. 81, 757-767 (1995).
  3. Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
  4. Baines, R. A., Robinson, S. G., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Postsynaptic expression of tetanus toxin light chain blocks synaptogenesis in Drosophila. Curr. Biol. 9, 1267-1270 (1999).
  5. Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).
  6. Bate, M. The embryonic development of the larval muscles in Drosophila. Development. 110, 791-804 (1990).
  7. Bate, M., Martinez Arias, A., Bate, M., Martinez Arias, A. . The Development of Drosophila melanogaster. , (1993).
  8. Baumgartner, S., JT, L. i. t. t. l. e. t. o. n., Broadie, K., MA, B. h. a. t., Harbecke, R., JA, L. e. n. g. y. e. l., Chiquet-Ehrismann, R., Prokop, A., Bellen, H. J. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87, 1059-1068 (1996).
  9. AH, B. r. a. n. d. Perrimon N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  10. Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
  11. Broadie, K., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Electrophysiological Approaches to the Neuromusculature. Drosophila Protocols. , 273-296 (2000).
  12. Broadie, K., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 144-166 (1993a).
  13. Broadie, K., Bate, M. Development of larval muscle properties in the embryonic myotubes of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 167-180 (1993b).
  14. Broadie, K., Bate, M. Activity-dependent development of the neuromuscular synapse during Drosophila embryogenesis. Neuron. 11, 607-619 (1993c).
  15. Broadie, K., Bate, M. Synaptogenesis in the Drosophila embryo: innervation directs receptor synthesis and localization. Nature. 361, 350-353 (1993d).
  16. Broadie, K., Bellen, H. J., DiAntonio, A., Littleton, J. T., Schwarz, T. L. The absence of Synaptotagmin disrupts excitation-secretion coupling during synaptic transmission. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10727-10731 (1994).
  17. Broadie, K., Prokop, A., Bellen, H. J., O’Kane, C. J., Schulze, K. L., Sweeney, S. T. Syntaxin and Synaptobrevin function downstream of vesicle docking in Drosophila. Neuron. 15, 663-673 (1995).
  18. Broadie, K., Rushton, E., Skoulakis, E. C. M., Davis, R. L. e. o. n. a. r. d. o. a 14-3-3 protein involved in learning, regulates presynaptic function. Neuron. 19, 391-402 (1997).
  19. Broadie, K., Skaer, H., Bate, M. Whole-embryo culture of Drosophila: development of embryonic tissues in vitro. Roux’s Arch. Develop. Biol. 201, 364-375 (1992).
  20. Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
  21. Deitcher, D. L., Ueda, A., Stewart, B. A., Burgess, R. W., Kidokoro, Y., Schwartz, T. L. Distinct requirements for evoked and spontaneous release of neurotransmitter are revealed by mutations in the Drosophila gene neuronal-synaptobrevin. J. Neurosci. 18, 2028-2039 (1998).
  22. Featherstone, D. E., Broadie, K. Surprises from Drosophila: genetic mechanisms of synaptic development and plasticity. Brain Res. Bull. 53, 501-511 (2000).
  23. Featherstone, D. E., Rushton, E. M., Hilderbrand-Chae, M., Phillips, A. M., Jackson, F. R., Broadie, K. Presynaptic glutamic acid decarboxylase is required for induction of the postsynaptic receptor field at a glutamatergic synapse. Neuron. 27, 71-84 (2000).
  24. Featherstone, D. E., Davis, W. S., Dubreuil, R. R., Broadie, K. Drosophila alpha- and beta-spectrin mutations disrupt presynaptic neurotransmitter release. J Neurosci. 21, 4215-4224 (2001).
  25. Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nat Neurosci. 5, 141-146 (2002).
  26. Featherstone, D. E., Rushton, E., Rohrbough, J., Liebl, F., Karr, J., Sheng, Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. An essential Drosophila glutamate receptor subunit that functions in both central neuropil and neuromuscular junction. J. Neurosci. 25, 3199-3208 (2005).
  27. Fergestad, T., Davis, W. S., Broadie, K. The stoned proteins regulate synaptic vesicle recycling in the presynaptic terminal. J Neurosci. 19, 5847-5860 (1999).
  28. Fergestad, T., Wu, M. N., Schulze, K. L., Lloyd, T. E., Bellen, H. J., Broadie, K. Targeted mutations in the syntaxin H3 domain specifically disrupt SNARE complex function in synaptic transmission. J Neurosci. 21, 9142-9150 (2001).
  29. Fergestad, T., Broadie, K. Interaction of stoned and synaptotagmin in synaptic vesicle endocytosis. J Neurosci. 21, 1218-1227 (2001).
  30. Goodman, C. S., Doe, C. Q., Bate, M., Martinez Arias, A. Embryonic Development of the Drosophila Central Nervous System. In The Development of Drosophila melanogaster. , 1131-1206 (1993).
  31. Harrison, S. D., Broadie, K., Goor, J. v. a. n. d. e., Rubin, G. M. Mutations in the Drosophila Rop gene suggest a function in general secretion and synaptic transmission. Neuron. 13, 555-566 (1994).
  32. Huang, F. D., Woodruff, E., Mohrmann, R., Broadie, K. Rolling blackout is required for synaptic vesicle exocytosis. J. Neurosci. 26, 2369-2379 (2006).
  33. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
  34. Jan, L. Y., Jan, Y. N. L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction. J. Physiol. 262, 215-236 (1976b).
  35. Kidokoro, Y., Nishikawa, K. I. Miniature endplate currents at the newly formed neuromuscular junction in Drosophila embryos and larvae. Neuroscience Research. 19, 143-154 (1994).
  36. Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. J. Neurosci. 17, 9642-9655 (1997).
  37. Mohrmann, R., Matthies, H. J., Woodruff III, E., Broadie, K. Stoned B mediates sorting of integral synaptic vesicle proteins. Neuroscience. 153, 1048-1063 (2008).
  38. Nishikawa, K. I., Kidokoro, Y. Junctional and extrajunctional glutamate receptor channels in Drosophila embryos and larvae. J. Neurosci. 15, 7905-7915 (1995).
  39. Renden, R., Berwin, B., Davis, W., Ann, K., Chin, C. T., Kreber, R., Ganetzky, B., Martin, T. F., Broadie, K. Drosophila CAPS is an essential gene that regulates dense-core vesicle release and synaptic vesicle fusion. Neuron. 31, 421-437 (2001).
  40. Rohrbough, J., Broadie, K. Electrophysiological Analysis of Synaptic Transmission in Central Neurons of Drosophila Larvae. J. Neurophysiol. 88, 847-860 (2002).
  41. Rohrbough, J., Rushton, E., Palanker, L., Woodruff, E., Matthies, H. J., Acharya, U., Acharya, J. K., Broadie, K. Ceramidase regulates synaptic vesicle exocytosis and trafficking. J. Neurosci. 24, 7789-7803 (2004).
  42. Rohrbough, J., Rushton, E., Woodruff, E. 3. r. d., Fergestad, T., Vigneswaran, K., Broadie, K. Presynaptic establishment of the synaptic cleft extracellular matrix is required for postsynaptic differentiation. Genes Dev. 21, 2607-2628 (2007).
  43. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J. Comp. Physiol.. A175, 179-191 (1994).
  44. Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O’Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
  45. Tsunoda, S., Salkoff, L. Genetic analysis of Drosophila neurons: Shal, Shaw, and Shab encode most embryonic potassium currents. J. Neurosci. 15, 1741-1754 (1995).
  46. Ueda, A., Kidokoro, Y. Longitudinal body wall muscles are electrically coupled across the segmental boundary in the third instar larva of Drosophila melanogaster. Invertebrate Neuroscience. 1, 315-322 (1996).
  47. Wu, C. F., Haugland, F. N. Voltage clamp analysis of membrane currents in larval muscle fibers of Drosophila. J. Neurosci. 5, 2626-2640 (1985).
  48. Yan, Y., Broadie, K. In vivo assay of presynaptic microtubule cytoskeleton dynamics in Drosophila. J Neurosci Methods. 162, 198-205 (2007).
  49. Yoshikami, D., Okun, L. Staining of living presynaptic nerve terminals with selective fluorescent dyes. Nature. 310, 53-56 (1984).
  50. Zagotta, W. N., Brainard, M. S., Aldrich, R. W. Single-channel analysis of four distinct classes of potassium channels in Drosophila muscle. J. Neurosci. 8, 4765-4779 (1988).
  51. Zhang, Y. Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. A living synaptic vesicle marker: synaptotagmin-GFP.. Genesis. 34, 142-145 (2002).

Tags

Electrophysiological RecordingDrosophila EmbryoGenetic ModelEmbryonic DevelopmentFunctional NeuroscienceDevelopmental ProgramsFunctional Electrical Signaling PropertiesFunctional Chemical SynapsesNeural Circuit FormationLate-stage EmbryogenesisEpidermal CuticleWater-polymerizing Surgical GlueControlled DissectionDorsal Longitudinal IncisionVentral Nerve CordBody Wall MusculatureWhole-cell Patch-clamp TechniquesIndividually-identifiable NeuronsSomatic MusclesIonic CurrentsAction Potentials
check_url/1348?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
Cite This Article
Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo. J. Vis. Exp. (27), e1348, doi:10.3791/1348 (2009).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image