Se describe un método para la extracción de ADN de alto peso molecular genómico a partir de biomasa planctónica se concentró en 0,22 micras filtros Sterivex, seguido por centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio para la purificación.
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Artículo de método
Extracción de ADN de 0,22 M Filtros Sterivex y centrifugación de densidad de cloruro de cesio Gradient
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Resumen
Resumen
Este método se utiliza para extraer el ADN de alto peso molecular genómico a partir de biomasa planctónica se concentró en 0,22 M filtros Sterivex que han sido tratados con buffer de almacenamiento / lisis y archivados a -80 ° C, y para purificar el ADN utilizando un gradiente de densidad de cloruro de cesio. El protocolo se inicia con dos etapas de incubación de una hora para liberar el ADN de las células y eliminar el ARN. A continuación, una serie de fenol: cloroformo y cloroformo extracciones se llevan a cabo, seguido por centrifugación para separar las proteínas y los componentes de la membrana celular, la recolección del extracto acuoso de ADN, y varias medidas de cambio de amortiguación para el lavado y concentrar el extracto. Quinta Parte describe la purificación opcional a través de gradiente de densidad de cloruro de cesio. Se recomienda trabajar con menos de 15 muestras al mismo tiempo para evitar la confusión y reducir el tiempo de protocolo. El tiempo total requerido para este protocolo depende del número de muestras que se extraen. De 10 a 15 muestras y suponiendo que el equipo de centrifugación adecuada está disponible, este protocolo completo debe tomar 3 días. Asegúrese de tener los hornos de hibridación para configurar la temperatura en el inicio del proceso.
Protocolo
Nota: Todos los reactivos utilizados en este protocolo que se distribuyan de las existencias de laboratorio que trabajan en pequeñas poblaciones-esto es muy importante para evitar la contaminación cruzada de muestras de ADN y la contaminación de las reservas de laboratorio. Además, al pipetear, asegúrese de cambiar las puntas de la pipeta para cada adición para evitar la contaminación cruzada.
Primera parte: lisis celular y la digestión
- Comience este protocolo por el deshielo de los filtros que contienen Sterivex biomasa planctónica previamente concentrada en el hielo. Para simplificar, aquí se describ....
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Discusión
Dependiendo de cuántas muestras se van a procesar, esto puede ser un procedimiento que consumen mucho tiempo debido a los dos pasos de la incubación de una hora, y los lavados repetidos y pasos de centrifugación. Es mejor plan de dos días para este procedimiento para dejar un montón de tiempo. Si hay problemas para conseguir el volumen de extracto final en el tubo de Amicon para reducir hasta 200-500μl durante la concentración de ADN y el lavado, trate de hacer más lavados de TE y centrifugaciones (repetir la tercera pa.......
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Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a la Fundación Canadiense para la Innovación, el British Columbia Fondo de Desarrollo de conocimientos y el Nacional de Ciencias e Ingeniería de Investigación (NSERC) de Canadá para apoyar los estudios en curso en las regiones de bajo nivel de oxígeno de las aguas oceánicas costeras y abiertas. JJW fue apoyado por becas de NSERC y DAW fue apoyado por becas de NSERC, Killam y la Fundación Centro TULA financiado por la diversidad microbiana y la evolución. SL fue apoyada por el Centro TULA financiado por la Fundación para la Diversidad microbiana y evolución.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Jeringa de 1 cc (aguja 26G5/8) | BD Biosciences | 309597 | |
| Jeringa de 1 ml (aguja 26G5/8) | BD Biosciences | 309597 | |
| Tubos Eppendorf de 1,5 ml | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| Tubos de 15 ml | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| Jeringa de 5 cc | BD Biosciences | 309603 | |
| Dispositivos de filtro centrífugo Amicon® Ultra-4 | EMD Millipore | UFC801096 | Límite nominal de peso molecular de 10.000 |
| Butanol | Fisher Scientific | A383-1 | Prepararlo saturado con agua (butanol:agua = 1:1) |
| Rotador de centrífuga, JA5.3 | Beckman Coulter Inc. | 368690 | |
| Centrífuga, Avanti® J-E | Beckman Coulter Inc. | 369003 | |
| Cloruro de cesio | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| Cloroformo:IAA (24:1) | Sigma-Aldrich | 25666-500ML | |
| Bromuro de etidio (EtBr) | Sigma-Aldrich | E1510-10ml | |
| Sal disódica de ácido etilendiaminotetraacético dihidratada | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Horno de hibridación | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C |
| Tampón de lisis | Sacarosa 0,75 M, EDTA 40 mM, Tris 50 mM (pH 8,3) | ||
| Lisozima | Sigma-Aldrich | L6876-5G | 125 mg en 1000 μl de tampón TE |
| Unidad de filtro centrífugo Microcon® Ultracel YM-30 | EMD Millipore | 42410 | Umbral de corte de 50 pb |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Fenol:Cloroformo:IAA (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| Proteasa K | Qiagen | 19133 | |
| RNasa A | Fisher Scientific | BP2539-100 | 10 μg/ml |
| Transiluminador de luz azul Safe Imager™ | Invitrogen | S37102 | |
| Dodecilsulfato de sodio (SDS) | Sigma-Aldrich | L4509 | SDS al 20% |
| Filtros Sterivex | Fisher Scientific | SVG010RS | |
| Sacarosa | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Centrífuga de sobremesa | Eppendorf | 5415D | |
| Tampón TE, pH 8,0 | |||
| Base Trizma® | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Rotador de ultracentrífuga, TLA 100 | Beckman Coulter Inc. | 343847 | |
| Tubo de ultracentrífuga (7X20 mm, PC) | Beckman Coulter Inc. | 343775 | |
| Portatubos para ultracentrífuga | Beckman Coulter Inc. | 348302 | |
| Ultracentrífuga, Optima® Max | Beckman Coulter Inc. |
Referencias
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014. Citeable Link.
A correction was made to "DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 ml RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 μl RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
