Beredning av Aplysia Sensomotorisk Neuronal cellkulturer

Summary

Primär kulturer<em> Aplysia</em> Sensoriska-motoriska nervceller skapa en modell förberedelse för att studera synaps bildning och synaptisk plasticitet<em> In vitro</em>. Denna video visar identifiering och microdissection av sensoriska och motoriska nervceller från<em> Aplysia</em> Ganglierna samt metoder för att etablera och upprätthålla sensoriska-motoriska nervceller i kultur.

Abstract

Nervsystemet av den marina mollusk Aplysia californica är relativt enkel och består av cirka 20.000 nervceller. Nervceller är stora (upp till 1 mm i diameter) och identifierbara, med tydliga storlekar, former, positioner och pigmenteringar, och cellen kroppar är externt exponerade i fem parade ganglier distribueras i hela kroppen av djuret. Dessa egenskaper har gjort utredare för att avgränsa kretsen underliggande specifika beteenden i djuret ^1. Den monosynaptic sambandet mellan sensoriska och motoriska nervceller är en central del av gäl-tillbakadragande reflex hos djuret, en enkel defensiv reflex där djuret drar tillbaka sitt bottengarn som svar på taktil stimulering av sifon. Denna reflex genomgår former av icke-associativa och associativa inlärning, inklusive sensibilisering, tillvänjning och klassisk betingning. Av särskild nytta för studier av synaptisk plasticitet, kan sensomotorisk synaps beredas i kultur, där välkarakteriserad stimuli framkallar former av plasticitet som har direkt korrelerar i djurets beteende ^2,3. Specifikt producerar tillämpning av serotonin en synaptisk förstärkning som, beroende på Application Protocol, varar i minuter (på kort sikt underlätta), timmar (mellanliggande sikt underlätta) eller dagar (lång sikt underlätta). Däremot producerar tillämpning av peptiden sändaren FMRFamide en synaptisk försvagning eller depression som, beroende på applikation protokollet kan pågå från minuter till dagar (långvarig depression). Den stora storleken på nervceller möjliggör upprepade skarpa elektrod inspelning av synaptisk styrka under perioder av dagar tillsammans med mikroinjektion av expressionsvektorer, siRNA och andra föreningar för att inrikta sig på särskilda signalering kaskader och molekyler och därigenom identifiera de molekylära och cellbiologiska steg som ligger bakom de förändringar i synaptisk effekt.

En ytterligare fördel med Aplysia kultur-systemet kommer från det faktum att de nervceller visar synapsen-specificitet i kulturen ^4,5. Således utgör sensoriska neuron inte synapser med sig själva (autapses) eller med andra sensoriska nervceller, inte heller bildar synapser med icke-målorganismer identifierade motoriska nervceller i kultur. Den varicosities, platser av synaptiska kontakter mellan sensoriska och motoriska nervceller, är tillräckligt stora (2-7 mikrometer i diameter) så att synapserna bildas (samt förändringar i synaptiska morfologi) med nervceller målet motor som skall undersökas i ljuset mikroskopisk nivå.

I denna video visar vi varje steg för att förbereda sensomotorisk neuron kulturer, inklusive anesthetizing vuxna och unga Aplysia, dissekera deras ganglier, proteas nedbrytning av ganglier, borttagning av bindväv med microdissection, identifiering av både sensoriska och motoriska nervceller och borttagning av varje celltyp som microdissection till plätering av motorn neuron, tillägg av sensoriska neuron och manipulation av sensoriska neurite formen kontakt med den odlade motoriska neuron.

Protocol

Beredning (se lösningar avsnitt i slutet av protokoll för sammansättning av lösningar) Förbered kultur rätter. Coat glas väl av Mattek glasbottnade kultur fat med poly-L-lysin (görs i natriumborat). Lägg tillräckligt för att helt täcka glaset väl och låt stå i> 1 timme (kan lämnas över natten). Noggrant bort poly-L-lysin genom att skölja i konstgjorda havsvatten (ASW) 4-5 gånger. Efter att den sista sköljningen, tillsätt 2 ml av 50% L15 (kompletteras med salter och som innehåller L-gl…

Discussion

I utarbetandet av ett Aplysia sensomotorisk kulturer har en något långsam inlärningskurva, eftersom det innebär utveckling av finmotorik förknippade med microdissection och manipulation av enskilda nervceller betraktas genom ett stereomikroskop. Enligt vår erfarenhet tar det ca 1-3 veckors praktik för att få friska isolerade sensoriska neuroner i kultur och ytterligare 1-3 veckor att lära sig att para sensoriska nervceller med motoriska nervceller. Vi förbereder rutinmässigt kulturer i en Labconco st…

Materials

Solutions needed for culture

1. 0.35 M MgCl₂, stored at room temperature, used for anesthesia.
2. Poly-L-lysine solution, Sigma: P-1524, MW >300,000, made in 0.1M Sodium Borate pH8.2 to 0.5mg/ml solution. Vortex well and filter sterilize through a 0.22 μm filter, store it at 4C°. Do not freeze-thaw.
3. L-15 Medium powder (Leibovitz) (Sigma: L4386) supplemented with the salts as below to make 1 liter
   

   L-15 powder	13.8g
   NaCl	15.4 g
   D-Glucose	6.24 g
   MgSO4•7H20	6.45g
   KCl	350 mg
   NaHCO3	170 mg
   MgCl2•6H2O	5.49 g
   CaCl2•2H2O	1.43g
   HEPES	3.53g

   Add ddH20 to 1 liter.  The pH should be about 7.4-7.5, add 10ml of 100X Pen/Strep solution, and filter-sterilize through a 0.22 µm filter. Store at 4C0 for no longer than 1 month.
4. Protease digestion solution: 1% Protease IX (1unit/mg) is made in L15 (supplemented with salts as above) or in ASW immediately before use, filter-sterilized through a 0.22 µm Millipore. 5mls should be enough for the ganglia from two animals (make sure the ganglia are completely immersed in protease solution). Sigma has reported that they will discontinue selling Protease IX. A substitute protease is: Dispase II (Roche Applied Science catalog # 04942078001).
5. Culture medium.  Immediately prior to preparing cultures, thaw a 10 ml aliquot of hemolymph and mix it with 10 mls of L15 (supplemented with salts as above) to make 20mls culture medium. Add 200 μl of 200mM L- Glutamine, mix well and use for preparing cultures. This medium should be prepared fresh each time cultures are made.
6. Artificial Seawater can be made from Instant Ocean (Aquarium Systems, Mentor, OH) or as follows: 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 30 mM MgCl₂(6H₂O), 20 mM MgSO₄, 10 mM CaCl₂(2H₂O), 10 mM HEPES, with pH adjusted to 7.4.