Primär kulturer<em> Aplysia</em> Sensoriska-motoriska nervceller skapa en modell förberedelse för att studera synaps bildning och synaptisk plasticitet<em> In vitro</em>. Denna video visar identifiering och microdissection av sensoriska och motoriska nervceller från<em> Aplysia</em> Ganglierna samt metoder för att etablera och upprätthålla sensoriska-motoriska nervceller i kultur.
Nervsystemet av den marina mollusk Aplysia californica är relativt enkel och består av cirka 20.000 nervceller. Nervceller är stora (upp till 1 mm i diameter) och identifierbara, med tydliga storlekar, former, positioner och pigmenteringar, och cellen kroppar är externt exponerade i fem parade ganglier distribueras i hela kroppen av djuret. Dessa egenskaper har gjort utredare för att avgränsa kretsen underliggande specifika beteenden i djuret 1. Den monosynaptic sambandet mellan sensoriska och motoriska nervceller är en central del av gäl-tillbakadragande reflex hos djuret, en enkel defensiv reflex där djuret drar tillbaka sitt bottengarn som svar på taktil stimulering av sifon. Denna reflex genomgår former av icke-associativa och associativa inlärning, inklusive sensibilisering, tillvänjning och klassisk betingning. Av särskild nytta för studier av synaptisk plasticitet, kan sensomotorisk synaps beredas i kultur, där välkarakteriserad stimuli framkallar former av plasticitet som har direkt korrelerar i djurets beteende 2,3. Specifikt producerar tillämpning av serotonin en synaptisk förstärkning som, beroende på Application Protocol, varar i minuter (på kort sikt underlätta), timmar (mellanliggande sikt underlätta) eller dagar (lång sikt underlätta). Däremot producerar tillämpning av peptiden sändaren FMRFamide en synaptisk försvagning eller depression som, beroende på applikation protokollet kan pågå från minuter till dagar (långvarig depression). Den stora storleken på nervceller möjliggör upprepade skarpa elektrod inspelning av synaptisk styrka under perioder av dagar tillsammans med mikroinjektion av expressionsvektorer, siRNA och andra föreningar för att inrikta sig på särskilda signalering kaskader och molekyler och därigenom identifiera de molekylära och cellbiologiska steg som ligger bakom de förändringar i synaptisk effekt.
En ytterligare fördel med Aplysia kultur-systemet kommer från det faktum att de nervceller visar synapsen-specificitet i kulturen 4,5. Således utgör sensoriska neuron inte synapser med sig själva (autapses) eller med andra sensoriska nervceller, inte heller bildar synapser med icke-målorganismer identifierade motoriska nervceller i kultur. Den varicosities, platser av synaptiska kontakter mellan sensoriska och motoriska nervceller, är tillräckligt stora (2-7 mikrometer i diameter) så att synapserna bildas (samt förändringar i synaptiska morfologi) med nervceller målet motor som skall undersökas i ljuset mikroskopisk nivå.
I denna video visar vi varje steg för att förbereda sensomotorisk neuron kulturer, inklusive anesthetizing vuxna och unga Aplysia, dissekera deras ganglier, proteas nedbrytning av ganglier, borttagning av bindväv med microdissection, identifiering av både sensoriska och motoriska nervceller och borttagning av varje celltyp som microdissection till plätering av motorn neuron, tillägg av sensoriska neuron och manipulation av sensoriska neurite formen kontakt med den odlade motoriska neuron.
I utarbetandet av ett Aplysia sensomotorisk kulturer har en något långsam inlärningskurva, eftersom det innebär utveckling av finmotorik förknippade med microdissection och manipulation av enskilda nervceller betraktas genom ett stereomikroskop. Enligt vår erfarenhet tar det ca 1-3 veckors praktik för att få friska isolerade sensoriska neuroner i kultur och ytterligare 1-3 veckor att lära sig att para sensoriska nervceller med motoriska nervceller. Vi förbereder rutinmässigt kulturer i en Labconco st…
Arbetet i labbet som omfattar odling av Aplysia nervceller finansieras av listan NIH R01 och NIH R21MH077921.
Solutions needed for culture
L-15 powder | 13.8g |
NaCl | 15.4 g |
D-Glucose | 6.24 g |
MgSO47H20 | 6.45g |
KCl | 350 mg |
NaHCO3 | 170 mg |
MgCl26H2O | 5.49 g |
CaCl22H2O | 1.43g |
HEPES | 3.53g |