レクチン抱合POROSビーズはHPLCに使用した。糖ペプチドの基準は、ポジティブとネガティブコントロールとして役立った。 MARS – 14欠乏、トリプシン消化したヒト血漿をクロマトグラフィー及びフロースルー(FT)と結合した分画はESI-LC-MS/MS分析のために収集された。 FTに比べて糖ペプチドを結合画分に濃縮した。
糖鎖は翻訳後修飾の重要なクラスです。一般的に分泌し、細胞外分子に見られる、糖鎖構造は細胞の内部状態を通知。腫瘍細胞上の糖鎖は、豊富なシアル酸およびフコース部分を持っている傾向がある。我々は、これらの癌関連糖鎖の変異体は、初期段階の疾患の診断を目指したバイオマーカー開発のために利用されることを提案する。したがって、我々は、レクチン、特定の糖鎖構造に結合するタンパク質から形成された親和性のマトリックスでのクロマトグラフィーを組み込んだ質量分析ベースのワークフローを開発しました。それぞれ、シアル酸およびフコースに結合するレクチンニワトコ黒(SNA)とヒイロチャワンタケ(AAL)は、共有結合POROSビーズ(アプライドバイオシステムズ社)に結合し、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)用PEEK製カラムに充填した。 (;アジレントMARS – 14)簡単に言うと、プラズマは、マルチプルアフィニティ除去システムを使用してfourteen最も豊富な蛋白質の枯渇した。枯渇したプラズマは、SNAまたはAAL HPLCによるトリプシン消化し、フロースルーと結合した画分に分離した。画分をN -結合型グリカンを除去するPNGaseFで処理し、QSTARのエリートのLC-MS/MSで分析した。データは、マスコットのソフトウェアを用いて分析した。実験的なデザインは、サッカロマイセスセレビシエ-レクチンキャプチャの特異性を監視するために使用されてからポジティブコントロール-フコシル化とシアル酸ヒトラクトフェリンの糖ペプチドとコントロールの高マンノース糖陰性が含まれています。このワークフローの主な機能は、HPLCのフォーマット、それらの脱アミドAsn-Xxx-Ser/ThrのモチーフからキャプチャしたとPNGaseF処理糖ペプチドの正の同定、および糖タンパク質の標準を使用して、品質評価から得られる再現性が含まれています。プロトコル最適化はまた、カラムの容量に、出発物質の最も効率的なキャプチャと溶出バッファーを識別し、完全な脱グリコシル化を確保するためにPNGaseF処理を監視するのに適切な比率を決定するが含まれています。今後の方向性は、乳がん患者と対照個体からのプラズマの質量分析ベースの検出実験を実行するには、このワークフローを使用して含まれています。
このプロトコルは糖鎖特異的に糖ペプチドを単離および同定するための迅速な方法を提供する。グリコシル化は、特に開発や病態の間に、生体内で広範囲に変化するにつれ、この手法は、質問の様々な対処するために必要となる場合があります。特に、我々は選択的バイオマーカー探索への第一歩として、癌関連エピトープで変更された糖ペプチドを豊かにする方法を使用しています。
この作品は、がんイニシアティブ、5U24CA126477 – 04の臨床プロテオミクス技術によってサポートされていました。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Human plasma | We make this in house | |||
Human lactoferrin | Sigma | L0520 | Trypsin-digest before use | |
Yeast invertase | Sigma | I0408 | Trypsin-digest before use | |
Oass HLB SPE cartridges | Waters | WAT094225 | 1 cc volume | |
ZipTip pipet tips | Fisher | ZTC1 8M0 96 | Millipore, C18 for 10 ml pipette | |
Tris | Fisher | BP154-1 | 99% | |
Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141 | 99% | |
Calcium chloride | Sigma | C4901 | 96% | |
Magnesium chloride | Sigma | M8266 | 98% | |
Acetic acid | Sigma | 242853 | 99.7% | |
pH indicator paper | Fisher | M95903 | Range 0-14 | |
Acetonitrile | Fisher | A998 | 99.9% | |
Formic acid | Pierce | 28905 | 99% | |
Phosphate-buffered saline | Invitrogen | 14190-136 | Without calcium and magnesium | |
Sodium azide | Sigma | 71289 | 99.5% | |
PNGase F | New England Biolabs | P0705L | Glycerol-free | |
Vacuum-filter flasks | Fisher | SCGVU05RE | 0.2 mm pores | |
POROS-AL beads | Applied Biosystems | 1-6028-02 | ||
Aleuria aurantia lectin | Vector Laboratories | L-1390 | ||
Sambucus nigra agglutinin | Vector Laboratories | L-1300 | ||
Sodium cyanoborohydride | Sigma | 296945 | 5.0 M solution |