Fluoreszenz In situ Hybridisierung (FISH)-Protokoll in menschlichen Spermien

Summary

Dieses Video-Artikel beschreibt Schritt für Schritt, wie man eine Samenprobe Prozess zu einer qualitativ hochwertigen Fluoreszenz zu erreichen<em> In situ</em> Hybridisierung auf menschliche Spermien. Die Vorbereitungen erhalten können Aneuploidietestung im Zusammenhang mit der klinischen Diagnose verwendet werden.

Abstract

Aneuploidien sind die häufigsten Chromosomenstörungen beim Menschen. Die meisten dieser Veränderungen ergeben sich aus meiotischen Fehler bei der gametogenic Prozess bei den Eltern. In der menschlichen Männchen, können diese Fehler auf die Produktion von Spermien mit numerischen Chromosomenanomalien, die eine erhöhte Gefahr der Übertragung dieser Anomalien auf die Nachkommen vertreten führen.

Aus diesem Grund hat die Technik der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) auf Spermakerne zu einem Protokoll weithin im Zusammenhang mit der klinischen Diagnose integriert. Diese Praxis liefert eine Schätzung der Frequenzen von numerischen Chromosomenanomalien in den Keimzellen der Patienten, die zur genetischen Reproduktion Rat zu suchen.

Bis heute sind die Chromosomen am häufigsten in Spermien FISH Analyse mit einbezogen Chromosomen X, Y, 13, 18 und 21.

Dieses Video-Artikel beschreibt Schritt für Schritt, wie zu verarbeiten und zu befestigen ein menschliches Sperma Probe, wie man decondense und denaturieren die Spermien Chromatin, wie es weitergehen soll, um Spermien FISH Präparate zu erhalten, und wie die Ergebnisse am Mikroskop sichtbar zu machen. Besondere Hinweise über die wichtigsten Schritte gegeben werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen.

Protocol

I. Aufbereitung der Probe und Zellfixierung Verlassen Sie die Samenprobe in sterilen Behältern bei Raumtemperatur für 20 Minuten, bis Verflüssigung. Übertragen Sie die Probe in ein Zentrifugenröhrchen und spinnen sie bei 1000g für 5 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig und den Überstand verwerfen mit einer Pasteurpipette. Add hypotonischen Lösung (KCl, 0,075 M) vorgewärmt auf 37 ° C, Tropfen für Tropfen, beim Mischen auf einem Vortex auf ein Endvolumen von 10 ml zu erhalt…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt, wie die menschliche Samenproben für den Erhalt von Spermien FISH Präparate Prozess. Mit diesem Protokoll ist es möglich, chromosomale Anomalien bei männlichen Keimzellen zu analysieren. Spermatozoen Aneuploidietestung hat Anwendungen entweder im Rahmen der Grundlagenforschung und in der reproduktiven Beratung der unfruchtbaren Männer. Obwohl in der klinischen Diagnostik der am häufigsten untersuchten Chromosomen X, Y, 13, 18 und 21, andere kommerzielle Sonden für eine breite Palette v…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Material	Roche	10197777001
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol	Material	Roche	10708976001
Acetic acid	Material	Merck	100.063
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit 20xSaline-Sodium Citrate 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI II) CEP 18/X/Y DNA probe NP-40 LSI 13/21 DNA probe	Material	Vysis Inc.	32-161075 30-805850 30-804941 30-171077 30-804820 30-171078
Centrifuge 5804R	Tool	Eppendorf
Centrifuge tube	Material	Nunc	347856
Coplin jar (glass)	Material	Barloworld Scientific	Hellendahl (ZCT278)
Coplin jar (plastic)	Material	Deltalab	191087
Cover slips (15×15)	Material	Knittel gläser	4600115
Cover slips (18×18)	Material	Knittel gläser	4600118
Diamond pencil	Material	Hammacher	335117010
Ethanol	Material	Merck	100.983
Formamide	Material	Roche	11814320001
Freezer	Tool	Zanussi
Gloves	Material	Sanyc	101/3300
HYBrite™	Tool	Vysis Inc.
Immersion Oil	Material	Olympus	35505
Incubator	Tool	Heraeus
Methanol	Material	Merck	106.009
Micropipette	Material	Labsystems	Finnpipette (4500000)
Micropipette replacement tip	Material	Daslab	16-2001
Nail varnish	Material	Quo-cosmetics
Olympus BX60 epifluorescence microscope	Tool	Olympus		Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red.
Pasteur Pipette	Material	Rubilabor	211.0230
Phase contrast microscope	Tool	Nikon Diaphot
Plastic pipette (3ml)	Material	Deltalab	200007
Potassium chloride (KCl)	Material	Fluka	60128
Rubber cement	Material	Best-test
Slides	Material	Knittel gläser	4520022
Slide Saver Boxes	Material	Deltalab	19276.1
Sterile container	Material	Deltalab	409726
Syringe	Material	PentaFerte	002022300
Thermometer	Material	Comark Instruments, Inc	KM12
Tri-distilled water	Material
Triton X-100	Material	Sigma	9002-93-1
Tweezers	Material	B/Braun	Aesculap (BD224R)
Vertical laminar flow hood	Tool	Burdinola	OR-ST 1500
Vortex mixer	Tool	Fisher Scientific	FB15012
Water bath	Tool	Raypa®