Este vídeo-artículo describe, paso a paso, cómo se procesa una muestra de semen para lograr una buena calidad de fluorescencia In situ Hibridación en los espermatozoides humanos. Los preparados obtenidos pueden ser utilizados para la detección de aneuploidía en el contexto del diagnóstico clínico.
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Artículo de método
Fluorescencia In situ (FISH) Protocolo en el esperma humano
En este artículo
Resumen
Resumen
Aneuploidías son las anomalías cromosómicas más frecuentes en los seres humanos. La mayoría de estas anomalías el resultado de errores durante el proceso de meiosis gametogénico en los padres. En los machos humanos, estos errores pueden conducir a la producción de espermatozoides con anomalías cromosómicas numéricas que representan un mayor riesgo de transmisión de estas anomalías a la descendencia.
Por esta razón, la técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH) en los núcleos de los espermatozoides se ha convertido en un protocolo ampliamente incorporado en el contexto del diagnóstico clínico. Esta práctica proporciona una estimación de la frecuencia de anomalías cromosómicas numéricas en los gametos de los pacientes que buscan el consejo genético reproductivo.
Hasta la fecha, los cromosomas más frecuentemente incluidos en el análisis de esperma de pescado son los cromosomas X, Y, 13, 18 y 21.
Este vídeo-artículo describe, paso a paso, cómo procesar y fijar una muestra de semen humano, cómo decondense y desnaturalizar la cromatina de los espermatozoides, la forma de proceder para obtener preparaciones de esperma de pescado, y la forma de visualizar los resultados en el microscopio. Comentarios especiales de los pasos más relevantes se dan para alcanzar los mejores resultados.
Protocolo
I. tratamiento de las muestras y la fijación de células
- Deja la muestra de semen en recipientes estériles a temperatura ambiente durante 20 minutos hasta la licuefacción.
- Transferir la muestra a un tubo de centrífuga y girar a 1000 g durante 5 minutos.
- Retire con cuidado y descartar el sobrenadante con una pipeta Pasteur.
- Añadir una solución hipotónica (KCl, 0.075M) pre-calentado a 37 ° C, gota a gota, mientras se mezcla en un vórtice de obtener un volumen final de 10 ml.
- Colocar el tubo en un baño de agua a 37 ° C durante 30 minutos.
- Centrifugar a 1000 g durante 5 minutos. Elimine con cuidado el sobrenadan....
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Discusión
Este protocolo describe la forma de procesar las muestras de semen humano para la obtención de preparaciones de esperma de pescado. El uso de este protocolo es posible analizar las anomalías cromosómicas en los gametos masculinos. Los espermatozoides de detección de aneuploidía tiene aplicaciones tanto en el contexto de la investigación básica y en el consejo reproductivo dado a los hombres infértiles. Aunque en el diagnóstico clínico de los cromosomas más estudiados son X, Y, 13, 18 y 21 de otras sondas comerciales par.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Los autores agradecen a J. Blanco y F. Vidal para su supervisión y estímulo, y Lucas J. por su asistencia técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| 1,4-ditiotreitol (DTT) | Material | Grupo Roche | 10197777001 | |
| 2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol | Material | Grupo Roche | 10708976001 | |
| Ácido acético | Material | Merck & Co., Inc. | 100.063 | |
AneuVysion® Kit multicolor de sondas de ADN
| Material | Vysis Inc. | 32-161075
| |
| Centrífuga 5804R | Herramienta | Eppendorf | ||
| Tubo de centrífuga | Material | Nalge Nunc international | 347856 | |
| frasco Coplin (vidrio) | Material | Barloworld Scientific | Hellendahl (ZCT278) | |
| frasco Coplin (plástico) | Material | Deltalab | 191087 | |
| Cubreobjetos (15x15) | Material | Knittel Glaser | 4600115 | |
| Cubrebjetes (18x18) | Material | Knittel Glaser | 4600118 | |
| Lápiz de diamante | Material | Hammacher | 335117010 | |
| Etanol | Material | Merck & Co., Inc. | 100.983 | |
| Formamida | Material | Grupo Roche | 11814320001 | |
| Congelador | Herramienta | Zanussi | ||
| Guantes | Material | Sanyo | 101/3300 | |
| HYBrite™ | Herramienta | Vysis Inc. | ||
| Aceite de inmersión | Material | Olympus Corporation | 35505 | |
| Incubadora | Herramienta | Heraeus Instruments | ||
| Metanol | Material | Merck & Co., Inc. | 106.009 | |
| Micropipeta | Material | Labsystems | Finnpipette (4500000) | |
| Punta de reemplazo para micropipeta | Material | Daslab | 16-2001 | |
| Barniz de uñas | Material | Quo-cosméticos | ||
| Microscopio epifluorescente Olympus BX60 | Herramienta | Olympus Corporation | Equipado con un filtro de triple banda para DAPI/Texas Red/FITC y filtros de banda única para Aqua, FITC y Texas Red. | |
| Pipeta de Pasteur | Material | Rubilabor | 211.0230 | |
| Microscopio de contraste de fases | Herramienta | Nikon Instruments | ||
| Pipeta de plástico (3 ml) | Material | Deltalab | 200007 | |
| Cloruro de potasio (KCl) | Material | Fluka | 60128 | |
| Cemento de caucho | Material | Mejor prueba | ||
| Láminas | Material | Knittel Glaser | 4520022 | |
| Cajas protectoras para portaobjetos | Material | Deltalab | 19276.1 | |
| Contenedor estéril | Material | Deltalab | 409726 | |
| Jeringa | Material | PentaFerte | 002022300 | |
| Termómetro | Material | Comark Instruments, Inc | KM12 | |
| Agua tri-destilada | Material | |||
| Triton X-100 | Material | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Pinzas | Material | B. Braun Medical | Aesculap (BD224R) | |
| Laminar vertical cabina de flujo laminar | Herramienta | Burdinola | OR-ST 1500 | |
| Mezclador de vórtice | Herramienta | Fisher Scientific | FB15012 | |
| Baño de agua | Herramienta | Raypa® |
Referencias
- Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).
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Reimpresiones y permisos
