Fluorescerande märkning av Drosophila Heart strukturer
Summary
Här beskriver vi ett grundläggande protokoll för fluorescerande märkning av olika delar av hjärtat rör från larv och vuxen<em> Drosophila melanogaster</em>. Dessa prover är väl lämpad för bildhantering via fluorescerande eller konfokalmikroskopi. Denna teknik möjliggör detaljerad strukturell analys av funktionerna i hjärtan från en kraftfull modell organism.
Abstract
Den<em> Drosophila melanogaster</em> Rygg fartyg, eller hjärtat, är en tubulär struktur består av ett enda lager av kontraktila cardiomyocytes, perikardiell celler som ansluter längs varje sida av hjärtat väggen, stödjande muskler alary och hos vuxna, ett lager av ventrala längsgående muskelcellerna. Den kontraktila fibrerna hus bevaras beståndsdelar i muskeln cytoarchitecture inklusive tätt packade buntar av myofibrils och cytoskelettala / submembranous proteinkomplex, som interagerar med homologa komponenter i den extracellulära matrisen. Här beskriver vi ett protokoll för fixering och den fluorescerande märkningen av särskilt hjärtinfarkt element från hjärtan dissekerade larver och delvis intakta vuxen<em> Drosophila</em>. Konkret visar vi märkning av sarcomeric F-aktin och α-actinin i larvernas hjärtan. Dessutom utför vi märkning av F-aktin och α-actinin i myosin-GFP uttrycka vuxna flugor och α-actinin och pericardin, en typ IV extracellulärmatrix kollagen, i vilda hjärtan typ vuxen. Särskild uppmärksamhet ägnas ett montage strategi för semi-intakt vuxna hjärtan som minimerar hantering och optimerar möjligheten för att upprätthålla integriteten i hjärt-rör och tillhörande vävnader. Dessa preparat är lämpliga för avbildning via lysrör och konfokalmikroskopi. Sammantaget ger detta förfarande för noggrann och detaljerad analys av de strukturella egenskaperna hos hjärtat från en kraftfull genetiskt fogligt modellsystem.
Protocol
Discussion
Här presenterar vi ett protokoll användbar för att förbereda och färgning av Drosophila melanogaster rygg fartyg och tillhörande vävnader för bildhantering via fluorescerande eller konfokalmikroskopi. Vi tillhandahåller ett kortfattat av stegen raffinerade av och ofta i vårt labb för effektiv färgning som tillåter väl löst in situ avbildning av larver och vuxna Drosophila rör hjärtat. Andra har beskrivit liknande metoder i förkortad form 2, 3, 4.
<p class="jove…Acknowledgements
Författarna tackar SI Bernstein (San Diego State University) för kritisk läsning och användbara förslag om utarbetandet av detta manuskript. Detta arbete stöddes av NIH bidrag till SI Bernstein, SDSU, och R. Bodmer, BIMR och genom ett post doc stipendium från västra staterna Affiliate av American Heart Association till G. Vogler och A. Cammarato.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ethylene glycol-bis (2-amino-ethylether) -N,N,N’,N’-tetra-acetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma-Aldrich® | E4378 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Reagent | Polysciences Inc. | 50-00-0 | |
| Triton-X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich® | 9002-93-1 | |
| Alexa Fluor® 594 phalloidin | Reagent | Invitrogen™ | A12381 | |
| Vectashield® Mounting Medium for Fluorescence with DAPI | Reagent | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Tungsten pins | Reagent | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pin holder | Reagent | Fine Science Tools | 26018-17 |
References
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. , (2009).
- Molina, M. R., Cripps, R. M. Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech Dev. 1, 51-59 (2001).
- Dulcis, D., Levine, R. B. Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster. J Neurosci. 2, 271-280 (2005).
- Zeitouni, B. Signalling pathways involved in adult heart formation revealed by gene expression profiling in Drosophila. PLoS Genet. 10, 1907-1921 (2007).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological change. J. Morphol. 2, 351-399 (1936).
- Miller, A. . The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. , (1950).
- Rizki, T. M. The circulatory system and associated cells and tissues. , (1978).
- Cammarato, A. Myosin transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 2, 553-562 (2008).
- Taghli-Lamallem, O. Dystrophin deficiency in Drosophila reduces lifespan and causes a dilated cardiomyopathy phenotype. Aging Cell. 2, 237-249 (2008).
- Kelso, R. J. a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 32, D418-D420 (2004).
- Dietzl, G. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 7150, 151-156 (2007).
- Mery, A. The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function. J Exp Biol. 211, 15-23 (2008).
