从胚胎斑马鱼和cDNA合成的基因表达分析的RNA分离

Summary

孤立的高品质，完整的RNA是一个必不可少的步骤在许多实验室的协议。在这里，我们从整个斑马鱼的胚胎，随后应用在各种实验程序，包括基因表达芯片分析cDNA合成RNA的提取证明。

Abstract

许多重要和复杂的实验室的程序，要求输入的高品质，完整的RNA。降级样品或杂质的存在可能导致灾难性的结果在下游的实验应用。因此，最重要的，使用坚实的技术与众多的保障措施和质量控制检查，以确保卓越的样本。在此，我们详细的协议隔离使用市售的化学变性和随后的清理，以去除DNA和使用商业RNA提取试剂盒杂质的痕迹，从整个斑马鱼胚胎的总RNA。作为RNA相对不稳定和轻松容易由核糖核酸酶裂解，大多数协议检测基因表达的cDNA的产品，是直接从RNA为模板合成。我们详细的程序转换成更稳定的cDNA使用市售的套件产品的RNA。纵观这些程序有多项质量控制检查，以确保样品不退化或受到污染的的。这些协议的最终产品是基因，是适合的芯片分析，RT – PCR或长期储存。

Protocol

第1部分：用Trizol试剂提取总RNA 当工作与RNA是非常重要的工作的环境中，无RNase的。简单的预防措施，如只使用RNA的程序保留移液器和喷涂工作区开始的程序之前，用去污剂试剂（例如，核糖核酸酶客队）是非常有益的。 在1.5 ml离心管要达到一个足够量的RNA池50个斑马鱼的胚胎，并删除尽可能多的水，用移液器。 立即加入TRIzol试剂1 250μL到离心管中含有?…

Discussion

RNA分子的脆弱性是最重要的考虑因素，应成为本议定书记住。应始终使用无菌设备，无RNase在实验室无RNase区。储备的只适用于RNA的程序实验室的一部分，它是有帮助的。核糖核酸酶去除产品，如核糖核酸酶，远离此区域应经常喷洒。 RNA样本应始终带手套处理，并放在冰上，防止退化。

该协议利用市售的试剂和试剂盒。另外，还有许多额外的试剂和RNA分离试剂盒，市场上可?…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Glycogen (5 mg/ml)		Ambion	9510
NanoDrop ND-100		Thermo Scientific	ND-1000
Pellet Pestles with Microfuge Tube		VWR	KT749520-0090
Phase Lock Gel Light, 1.5 ml		Eppendorf	2302800
Phenol, Tris-saturated		Roche Diagnostics	3117944001
RNAse Away		VWR	17810-491
RNAse-Free DNase Set		Qiagen	79254
RNEasy Mini Kit		Qiagen	74104
SuperScript® First-Strand Synthesis System for RT-PCR		Invitrogen	11904-018
TRIzol		Invitrogen	15596-026