फैटी एसिड में मात्रात्मक Phosphoproteomics प्रेरित Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
एक मात्रात्मक phosphorylation cryolysis, यूरिया solubilziation, HILIC fractionation और phosphorylated पेप्टाइड्स के iMac संवर्धन का उपयोग प्रक्रिया का विवरण.
Abstract
इस प्रोटोकॉल isotopically भारी और प्रकाश एस cerevisiae कोशिकाओं के फैटी एसिड oleate, के साथ विकास और उत्तेजना का वर्णन करता है. कक्ष एक गेंद मिल चक्की और जिसके परिणामस्वरूप यूरिया solubilization द्वारा समाधान में लाया grindate में एक cryolysis प्रक्रिया का उपयोग कर भूमि रहे हैं. यह प्रक्रिया एक metabolically निष्क्रिय स्थिति में कोशिकाओं के lysis के लिए अनुमति देता है, phosphorylation के संरक्षण और सेल lysis के दौरान phosphoproteome के पुनरभिविन्यास को रोकने. कमी, alkylation, trypsin प्रोटीन के पाचन के बाद, नमूने C18 स्तंभों और नमूना हाइड्रोफिलिक बातचीत क्रोमैटोग्राफी (HILIC) का उपयोग fractionation द्वारा कम जटिलता पर desalted हैं. HILIC स्तंभों preferentially हाइड्रोफिलिक अणुओं है जो अच्छी तरह से phosphoproteomics के लिए अनुकूल है बनाए रखने. Phosphorylated पेप्टाइड्स के बाद गैर phosphorylated समकक्षों की तुलना में chromatographic प्रोफ़ाइल में elute करते हैं. Fractionation के बाद, phosphopeptides immobilized धातु क्रोमैटोग्राफी, जो phosphopeptide संवर्धन के लिए प्रभारी आधारित समानताएं पर निर्भर करता है का उपयोग कर समृद्ध कर रहे हैं. इस प्रक्रिया के अंत में नमूने के मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया जा करने के लिए तैयार हैं.
Protocol
Discussion
इस विधि phosphopeptides कि मात्रात्मक विश्लेषण किया जा सकता है की एक संवर्धन निकलेगा. मानकों की एक संख्या इस प्रोटोकॉल में बदला जा सकता है, लेकिन सबसे महत्वपूर्ण पहलू को याद करने के लिए अपने phosphorylation संरक्षित है. मा?…
Acknowledgements
हम तकनीकी सहायता के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण और उपयोगी चर्चा के साथ डा. रिच रोजर्स का शुक्रिया अदा करना होगा, और डीआरएस. रोब. Moritz, जेफ Ranish, और उपयोगी विचार – विमर्श के लिए हामिद Mirzai.
इस काम उत्कृष्टता के NIH केंद्र द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 | Sigma-Aldrich | 608033 | ||
| Isotec™ L-Lysine-15N2 | Sigma-Aldrich | 609021 | ||
| GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid | Invitrogen | 70011044 | ||
| SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | ||
| Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420 | ||
| Retsch PM100 Ball Mill Grinder | Retsch | 20.540.0001 | ||
| Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar | Retsch | 01.462.0148 | ||
| Ultramicrospin C18 column | The Nest Group | SUM SS10 | ||
| Sep-Pak Vac 500 mg C18 | Waters | WAT043395 | ||
| TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column | TOSOH BioSciences | 13071 | This is the HILIC chromatographic column. | |
| Guard column 4.6 mm ID x1 cm | TOSOH BioSciences | 19021 | We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column. | |
| PHOS-Select™ Iron Affinity Gel | Sigma-Aldrich | P9740 | This is the IMAC resin. Aliquot and store. |
References
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