Metod för mätning av Viral Fusion Kinetics på enskild partikel nivå
Summary
Vi presenterar ett<em> In vitro,</em> Två färger fluorescens analys för att visualisera fusion av enstaka viruspartiklar med en vätska mål tvåskiktsmembran. Genom märkning viruspartiklar med fluoroforer att differentiellt fläcken virusets membran och dess interiör, kan vi övervaka kinetik hemifusion och porbildning.
Abstract
Membran fusion är ett viktigt steg vid införandet av höljeförsedda virus in i cellerna. Konventionella fusion analyser rapport vanligtvis på ett stort antal av fusion händelser, gör det svårt att kvantitativt analysera sekvensen av de inblandade molekylära steg. Vi har utvecklat en in vitro, tvåfärgad fluorescens-analysen för att övervaka kinetik av enstaka viruspartiklar fixering med ett mål tvåskiktsmembran på huvudsakligen vätska stöd.
Influensa viruspartiklar inkuberas med en grön lipofil fluoroforen att färga membranet och en röd hydrofil fluoroforen att färga den virala interiör. Vi deponera en ganglioside innehåller membranet på dextran-functionilized glasytan ett flöde cell, Inkubera viruspartiklar på plana tvåskiktsmembran och bild fluorescens av en 100 x 100 ìm 2-området, som innehåller flera hundra partiklar på en CCD kameran. Genom imaging både röda och gröna fluorescens, kan vi övervaka samtidigt beteende membranet färg (grön) och vattenfasen innehåll (röd) av partiklarna.
Vid sänkning av pH till ett värde som underskrider den fusion pH, kommer partiklarna säkring med membranet. Hemifusion, en sammanslagning av den yttre bipacksedel virala membran med den yttre bipacksedel målet membranet, kommer att synas som en plötslig förändring i grön fluorescens av en partikel. Vid den efterföljande fusion av de två återstående distala flygblad en por kommer att bildas och den röda som avger fluoroforen i det virala partiklar kommer att släppas under målet membranet. Denna händelse kommer att leda till en minskning av röda fluorescens av enskilda partiklar. Slutligen, rapporterar den integrerade fluorescens från ett pH-känsligt fluoroforen som är inbäddat i målet membranet på den exakta tiden för pH-värdet sjunker.
Från de tre fluorescens-time spår, kan alla viktiga händelser (pH-värdet sjunker, lipid blandning på hemifusion, innehåll blandning på porbildning) nu hämtas på ett enkelt sätt och för varje partikel individuellt. Genom att samla förfluten tid för de olika övergångar för många enskilda partiklar i histogram, kan vi bestämma livslängd för motsvarande intermediärer. Även dolda intermediärer som inte har en direkt fluorescerande observerbart kan visualiseras direkt från dessa histogram.
Protocol
Discussion
Beredning av vätska och kontinuerligt stöd bilayers fett kan vara en utmaning. Spårmängder av kontaminerande material eller ytdefekter kommer att förhindra spridning av bilayers. Noggrann rengöring och deponering av ett enhetligt lager av dextran är viktiga.
Långvarig avbildning av viruspartiklar kan bleka fluorescerande etiketter eller orsaka dem att bli inaktiverat. Bild-skador av detta slag är välkänt i bio-imaging och enda fält molekyl och är allmänt tros härröra från ge…
Acknowledgements
Arbetet stöddes av NIH bidrag AI57159 (till SCH) och AI72346 (till AMvO). SCH är en Howard Hughes Medical Institute Investigator.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Corning cover glass squares, 25 mm | Sigma | CLS286525 | ||
| Fused silica slides | Technical Glass | |||
| Staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | ||
| (3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane | Gelest | SIG5840.1 | ||
| Dextran T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | ||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti | 850375 | ||
| 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti | 850457 | ||
| Cholesterol | Avanti | 700000 | ||
| N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | ||
| Streptavidin, fluorescein conjugate | Invitrogen | S-869 | ||
| Disialoganglioside GD1a from bovine brain | Sigma | G2392 | ||
| Mini Extruder | Avanti | 610000 | ||
| 0.1 micron polycarbonate membrane filters | Whatman | 800309 | ||
| 10 mm drain discs (membrane supports) | Whatman | 230300 | ||
| Sulforhodamine b sodium salt | S1402 | |||
| Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18) | See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol | |||
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | ||
| Nikon fluorescence microscope | Nikon | TE2000-U | ||
| Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective | Nikon | |||
| Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser | Coherent | |||
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702213 |
References
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
