الفيروسة البطيئة الإنتاج
Summary
لجعل lentiviruses ، هي ناقلات transfected الحمض النووي في الخلايا البشرية 293. بعد الحصاد ، وتركيز طاف ، يتم تحديد عيار الفيروس عن طريق التعبير مضان مع تدفق عداد الكريات.
Abstract
تدخل الحمض النووي الريبي (رني) هو نظام لإسكات الجينات في الخلايا الحية. في رني ، في تسلسل الجينات مثلي قصيرة الرناوات التدخل (سيرنا) يتم إسكاتها في دولة ما بعد النسخي. ويمكن التعبير عن الرناوات دبوس الشعر القصير ، والسلائف لسيرنا ، وذلك باستخدام الفيروسة البطيئة ، مما يسمح لرني في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. Lentiviruses ، مثل فيروس نقص المناعة البشرية ، قادرة على اصابة كل من الانقسام وعدم تقسيم خلايا. سنقوم بشرح الإجراء الذي lentiviruses إلى الحزمة. التغليف يشير إلى إعداد الأكفاء من نواقل فيروس الحمض النووي. وتستند نظم الإنتاج Lentiviral ناقلات على نظام "تقسيم" ، حيث تم تقسيم الجينوم الفيروسي في البنى الطبيعية المساعد الفردية البلازميد. تقسيم هذه العناصر الفيروسية المختلفة إلى أربع ناقلات منفصلة يقلل من خطر خلق الفيروس قادر على تكرار إعادة التركيب من قبل العارض للجينوم lentiviral. هنا ، transfected عابر متجه تحتوي على shRNA من الاهتمام والتعبئة والتغليف ناقلات الثلاث (ف VSVG ، pRSV ، pMDL) في خلايا الإنسان 293. على الأقل بعد فترة حضانة لمدة 48 ساعة ، هو حصاد طاف الفيروس التي تحتوي على ومركزة. أخيرا ، يتم تحديد عيار الفيروس بواسطة مراسل (الفلورية) التعبير مع تدفق عداد الكريات.
Protocol
Acknowledgements
ساندلر الربو مركز البحوث الأساسية (SABRE)
مؤسسة ساندلر
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS | Invitrogen | |||
| FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG | Roche | |||
| Bleach | Clorox | |||
| 10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes | Falcon | 353003 | ||
| Multichannel pipette | Rainin | |||
| Filtered pipette tips | Rainin | |||
| 1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm) | Eppendorf | |||
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | |||
| Tissue culture incubator at 5% CO2 | Coulter | |||
| Beckman SW41T.I rotor | ||||
| Beckman ultracentrifuge | Beckman | |||
| Fluorescent microscope | Coulter | |||
| FACS Array | Beckman |
References
- Reiser, J. Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors.. Gene Therapy. , 72-7211 (2000).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. . J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
