人类胚胎干细胞核型分析用染色体铺展制备

摘要

核型分析是一种简单且实用的技术，广泛用于检测遗传变异。本文介绍了一种逐步操作的实验方案，用于制备人胚胎干细胞的染色体铺展样本，以监测在培养条件下维持的人胚胎干细胞的染色体状态。

摘要

尽管人类胚胎干细胞（hESC）已被证明具有稳定的二倍体核型 ¹许多研究报道，根据培养条件的不同，细胞容易获得染色体异常，例如整条或部分染色体的增加。事实上，在长期培养过程中，当使用酶法或化学解离方法时，可观察到核型改变。 ^2,3,4，而通过手工解剖法对克隆进行传代可维持稳定的核型 ⁵此外，环境的改变（例如去除饲养层细胞）似乎也会损害人类胚胎干细胞的遗传完整性 ^3,6. 一旦染色体改变可能影响细胞生理学，对人胚胎干细胞遗传完整性的表征就显得尤为重要 在 体外 考虑到人胚胎干细胞（hESC）是胚胎发生研究和药物测试中的重要工具，这一点至关重要。此外，对于未来的治疗应用而言，染色体改变是一个实际问题，因其常与致癌作用相关。

本文展示了一种简单且实用的方法，用于制备高质量的染色体铺展样本，以便后续通过G显带、FISH、SKY或CGH技术对染色体组进行分析^7,8。我们建议每传代5次定期检查一次染色体状态，以监测易位和非整倍性等异常的出现情况。

Priscila Britto 和 Rafaela Sartore 对本论文的贡献相同。

方案

仪器

• 组织培养孵育箱，37°C，5% CO₂
• 离心机
• 移液器套装（1000 μL，100 μL）
• 37°C 水浴锅
• 90°C 水浴锅，用于提供热水蒸汽
• 相差显微镜

第一步

用秋水仙胺处理细胞

在此实验中，我们使用了培养在经丝裂霉素C（Sigma）灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（mEF）上的H9人胚胎干细胞系，并在添加了20%敲除血清替代物（KSR，Gibco）和8 ng/mL成纤维细胞生长因子（FGF-2，R&D）的DMEM/F12培养基（Invitrogen）中维持培养。

为了获得大量的中期分裂相，建议使用有丝分裂指数较高的培养物，其中含有大量正在分裂的细胞。

1. 从培养箱中取出培养瓶，在超净工作台中加入秋水仙胺，使其终浓度为0,1μg/mL。
2. 将培养瓶放回培养箱，孵育3小时，使抑制剂诱导细胞发生中期有丝分裂阻滞，此时染色体高度凝集，可在显微镜下清晰观察。

固定细胞

3. 吸出培养基，加入足量的0.05%胰蛋白酶/E....

讨论

染色体铺片的制备是通过常规技术（如G显带）以及更复杂的技术（如FISH、SKY和CGH）对胚胎干细胞遗传状态进行成功分析的关键步骤。

通过调整秋水仙胺孵育时间（取决于细胞周期长度），该操作可用于多种细胞类型。对于胚胎干细胞集落，我们孵育3小时，而对于类胚体（EB），孵育时间可长达6小时。

在处理细胞聚集体（如类胚体）时，需要充分解离以获得单细胞悬液。在此情况下，经过胰蛋白酶消化和机械解离后，可使用40μm尼龙细胞滤网（BD Biosciences），然后继续后续操作步骤（从“操作步骤”部分的第4步开始）。

在本实验方案中需注意，应将细胞悬液“紧贴”载玻片滴加，以避免染色体过度铺展，从而减少人为假象的产生。

我们认为，该实验方案不仅可被从事胚胎干细胞研究的实验室常规应用，也可为其他致力于研究各类干细胞中染色体不稳定性问题的研究人员提供一种有用且简便的工具。

....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 ml 离心管	Techno Plastic Products	91015
秋水仙胺 Karyo MAX	GIBCO, by Life Technologies	15212-012
EDTA	Isofar	721
冰醋酸	Isofar	100
甲醇	Isofar	208
氯化钾 (KCl)	Merck & Co., Inc.	104.931.000
载玻片	Bioslide	7105-1
胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	T4799