सीडीएनए के प्रत्यक्ष intranuclear इंजेक्शन बाद mitotic कोशिकाओं के लिए एक प्रभावी तकनीक अभिकर्मक है. इस विधि एकल या एकाधिक सीडीएनए constructs से heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर प्रदान करता है और एकल कक्ष assays के एक किस्म के साथ एक physiologically प्रासंगिक वातावरण में अध्ययन किया जा प्रोटीन समारोह में सक्षम बनाता है.
प्राथमिक neuronal सेल संस्कृतियों मूल्यवान उपकरण हैं करने के लिए प्रोटीन समारोह का अध्ययन के बाद से वे अमर सेल लाइनों की तुलना में एक अधिक प्रासंगिक जैविक प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं. हालांकि, बाद mitotic प्राथमिक न्यूरॉन्स की प्रकृति electroporation या रासायनिक मध्यस्थता अभिकर्मक के रूप में आम प्रक्रियाओं का उपयोग करते हुए प्रभावी heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति को रोकता है. इस प्रकार, अन्य तकनीकों के क्रम में प्रभावी ढंग से इन गैर विभाजित कोशिकाओं में प्रोटीन व्यक्त करने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए.
इस अनुच्छेद में, हम अलग वयस्क सहानुभूति न्यूरॉन्स में सीडीएनए constructs के intranuclear इंजेक्शन प्रदर्शन के लिए आवश्यक कदम का वर्णन. इस तकनीक है, जो न्यूरॉन्स के विभिन्न प्रकार के लिए लागू किया गया है सफलतापूर्वक heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकते हैं. microinjection प्रक्रिया के लिए आवश्यक उपकरण एक औंधा माइक्रोस्कोप कोशिकाओं, सीडीएनए समाधान है कि एक एन 2 (छ) दबाव वितरण प्रणाली से जुड़ा है के साथ भरा एक गिलास इंजेक्शन pipet, और एक micromanipulator कल्पना भी शामिल है . micromanipulator दबाव एन 2 की एक संक्षिप्त पल्स सीडीएनए समाधान pipet सिरे से बेदखल करना microinjection pipet के इंजेक्शन गति निर्देशांक.
इस तकनीक को कई अन्य अभिकर्मक तरीकों के साथ जुड़े विषाक्तता नहीं है और कई डीएनए constructs करने के लिए सक्षम बनाता है एक सुसंगत अनुपात में व्यक्त किया जा. इंजेक्शन कोशिकाओं की कम संख्या microinjection प्रक्रिया अच्छी तरह electrophysiological रिकॉर्डिंग और ऑप्टिकल इमेजिंग के रूप में एकल कोशिका के अध्ययन के लिए उपयुक्त बनाता है, लेकिन जैव रासायनिक assays कि कोशिकाओं और उच्च अभिकर्मक क्षमता की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता के लिए आदर्श नहीं हो सकता. हालांकि intranuclear microinjections उपकरण और समय के निवेश की आवश्यकता है, एक physiologically प्रासंगिक वातावरण में heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को प्राप्त करने की क्षमता इस तकनीक प्रोटीन समारोह की जांच के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण बना देता है.
आम समस्याओं का सामना करना पड़ा और सुझाव:
जैसा कि पहले उल्लेख सफल परमाणु इंजेक्शन टिशू कल्चर प्लेटों के अनुयायी कोशिकाओं होने पर निर्भर करते हैं. इंजेक्शन के शुरू स्थगित कुछ घंटे सेल पृथक्करण प्रक्रिया निम्नलिखित न्यूरॉन्स बर्तन के नीचे का पालन करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, 0.1 मिलीग्राम / उच्च आणविक भार (सिग्मा, सेंट लुइस, MO) पाली एल lysine एड्स व्यंजन के नीचे की सतह के लिए न्यूरॉन्स के आसंजन के मिलीलीटर के साथ कोटिंग व्यंजन.
Microinjection pipets की रुकावट, खासकर जब डीएनए के एक उच्च एकाग्रता इंजेक्षन करने का प्रयास, एक लगातार समस्या हो सकती है. उच्च गुणवत्ता जुदाई स्तंभों का उपयोग प्लास्मिड डीएनए को अलग करने और शुद्ध, और अतिरिक्त शुद्धि उल्लेख किया है (स्पिन फिल्टर, हेमाटोक्रिट ट्यूबों में कताई) कदम प्रदर्शन particulates हटाने के इंजेक्शन लगाने के लिए पहले की मदद कर सकते हैं. इंजेक्शन के दौरान दबाव सुई लगानेवाला के "स्वच्छ" समारोह (0.2 एस के लिए पर्याप्त है) का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन है कि यदि समस्या हल नहीं होती, एक नया इंजेक्शन pipet इस्तेमाल किया जाना चाहिए. यदि microinjection pipets के बहुमत एक इंजेक्शन सत्र के दौरान भरा हो गया है, कांच pipet खींचने की सेटिंग में फेरबदल करने के लिए एक बड़े खोलने के साथ microinjection pipet सुझावों उत्पादन पर विचार करें.
एक और मुद्दा है कि परमाणु इंजेक्शन के दौरान उठता टिशू कल्चर व्यंजन के नीचे की सतह के असमता है. यह परिवर्तनशीलता सीधे नाभिक को लक्ष्यीकरण इंजेक्शन pipet सुझावों की सटीकता को प्रभावित करता है गहराई के बाद से इंजेक्शन के दौरान pipet traverses तय हो गई है. इसलिए, इस सीमा को z-अक्ष एक ही थाली के भीतर इंजेक्शन के दौरान समायोजित किया जाना चाहिए. यह स्पष्ट हो सकता है जब एक समायोजन आवश्यक है: परमाणु इंजेक्शन के कोई संकेत नहीं है (नाभिक या सेल पूरी तरह से याद किया जाता है में कोई सफेद पंख), या इंजेक्शन pipet टिप पकवान के नीचे करने के लिए करीब आता है (सेल compressing या डिश के तल में भी pipet दुर्घटनाग्रस्त टिप). ग्लास, क्लोनिंग सिलेंडरों (. आयुध डिपो 10 मिमी, बिल्ली सं 2090-01010, Bellco ग्लास, Vineland, NJ) न्यूरॉन्स के चढ़ाना के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता है उन्हें एक छोटे, अधिक सीमित क्षेत्र में प्रतिबंधित है, इसलिए स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक दूरी को कम इंजेक्शन के बीच इंजेक्शन pipet. ये क्लोनिंग सिलेंडरों microinjections प्रदर्शन करने के लिए पहले हटा रहे हैं.
तकनीक की कमियां:
Intranuclear microinjections तकनीकी की मांग कर रहे हैं, जो धैर्य और ऑपरेटर द्वारा मैनुअल निपुणता की एक उच्च डिग्री की आवश्यकता होती है. इस तकनीक के साथ प्रवीणता, जैसे किसी भी अन्य कौशल के साथ, अभ्यास के साथ आता है. इस प्रकार, यह रिपोर्टर जीन की परमाणु इंजेक्शन वास्तविक प्रयोगों का प्रयास करने से पहले अकेले अभ्यास की सलाह दी है. आगे इंजेक्शन प्रक्रिया में सहायता करने के लिए, यह संभव हो सकता micromanipulator और एक कंप्यूटर प्रोग्राम में सुई लगानेवाला दबाव के इस कदम को मजबूत कर सकते हैं. इगोर प्रो (WaveMetrics, झील Oswego, या) जैसे कार्यक्रम microinjection सेटिंग्स की दुकान और अर्द्ध स्वचालित रूप से इंजेक्शन की प्रक्रिया multifunctional नियंत्रकों (ShuttlePro, समोच्च डिजाइन, Windham, राष्ट्रीय राजमार्ग) कार्यक्रम का उपयोग किया जा सकता है (के लिए 6,7,8 देख विवरण).
Intranuclear microinjection तकनीक का एक और दोष कम सफलता दर है. प्रयास परमाणु इंजेक्शन का लगभग 10-20% प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए सीसा. Whilst यह क्षमता अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त है कि व्यक्त कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में, उदाहरण के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, विभिन्न जैव रासायनिक assays के लिए यह पर्याप्त नहीं किया जा सकता है की आवश्यकता नहीं है हो सकता है.
तकनीक के अनुप्रयोग:
अपनी कमियों के बावजूद, डीएनए के intranuclear microinjection heterologously न्यूरॉन्स में प्रोटीन व्यक्त करने के लिए एक अत्यंत उपयोगी तकनीक है.
प्रोटीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर इंजेक्शन, एक अत्यधिक सक्रिय सीएमवी जीन प्रतिलेखन, और नाभिक में plasmids के लंबे स्थिरता विनियमन प्रमोटर के दौरान नाभिक में जारी plasmids के बड़ी संख्या की वजह से परमाणु microinjections के साथ प्राप्त कर रहे हैं. अभिव्यक्ति से अधिक प्रोटीन प्रमुख नकारात्मक प्रयोगों जहां heterologous प्रोटीन का उच्च स्तर के लिए अंतर्जात प्रोटीन डूब के लिए आवश्यक हैं में विशेष रूप से उपयोगी है. Intranuclear इंजेक्शन का एक अन्य लाभ के नाभिक को सीडीएनए constructs का एक सुसंगत अनुपात देने जब एकाधिक constructs इंजेक्ट कर रहे हैं करने की क्षमता है. अन्य अभिकर्मक तरीकों के साथ, यह मुश्किल है reproducibly प्रत्येक डीएनए के एक ही अनुपात परिचय विभिन्न कक्षों में एक ही थाली के भीतर और transfections के बीच का निर्माण. सीडीएनए समाधान के नाभिक में प्रत्यक्ष इंजेक्शन परिवर्तनशीलता के इस स्रोत समाप्त व्यक्त प्रोटीन के अनुपात को प्रभावी ढंग से हो titered की अनुमति देता है है.
अभिकर्मक के पारंपरिक तरीकों की वजह से 9 नाभिक और रासायनिक अभिकर्मक reag के साथ जुड़े विषाक्तता में डीएनए की कम समावेश बाद mitotic कोशिकाओं में सीमित प्रभाव है10 पिता. परमाणु microinjections आनुवंशिक सामग्री नाभिक में यंत्रवत् शुरू करने से इन मुद्दों पर काबू पाने. हालांकि इस तकनीक को और अधिक शामिल है, एक कार्यात्मक जैविक प्रणाली में एक प्रोटीन के प्रभाव का अध्ययन करने की क्षमता, अंतर्जात संकेत दे रास्ते के साथ पूरा, अधिक से अधिक इस तकनीक का श्रमसाध्य प्रकृति के लिए compensates.
राष्ट्रीय संस्थानों के साथ पशु की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के अनुसार सभी जानवरों पर प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया.
हमारी प्रयोगशाला अनुसंधान NIH के अंदर का अनुसंधान कार्यक्रम, शराब सेवन और शराब पर राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित है.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Ultrafree-MC Filter Unit | Millipore | UFC30VV00 | Durapore PVDF filter; 0.1 μm pore-size | |
TE buffer | Quality Biological, Inc | 351-010-131 | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0 | |
Micro-hematocrit capillary tubes | Fisher Scientific | 22-362-574 | Unheparinized Preparation: Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95°C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up. |
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Microcentrifuge | Eppendorf | 5417 R | With a fixed angle or swinging-bucket rotor | |
Microloader 20 μl pipet tips | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
Microinjection capillary glass | World Precision Instruments | TW120F-4 | Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length | |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | With platinum-iridium box filament (part # FB330B) | |
Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope | Nikon | 20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table | ||
Charge-coupled device (CCD) camera | Cohu Inc. | 6410 | ||
Video monitor | Sony Corporation | PVM-122 | Black and White, 9” screen | |
Micromanipulator system | Eppendorf | 5171 | ||
Microinjection Unit | Eppendorf | FemtoJet Express | ||
Microinjection controller | Contour Design | S-PROV2 | Programmable multimedia controller | |
Igor Pro | WaveMetrics | Version 4.05A | Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda |