Direkt intranuclear injektion av cDNA är ett effektivt transfektion teknik för post-mitotiska celler. Denna metod ger höga nivåer av heterologa proteiner uttryck från enstaka eller flera cDNA konstruktioner och gör proteiners funktion studeras i en fysiologiskt relevant miljö med en mängd olika enda cell analyser.
Primär neuronal cell kulturer är värdefulla verktyg för att studera proteiners funktion eftersom de står för en mer biologiskt relevanta system jämfört med förevigade cellinjer. Dock hindrar efter mitotiska natur primära neuroner effektiva heterologa protein uttryck med hjälp av gemensamma förfaranden som elektroporation eller kemiskt medierade transfektion. Därför måste andra metoder användas för att effektivt uttrycka proteiner i dessa icke-delande celler.
I denna artikel beskriver vi de åtgärder som krävs för att utföra intranuclear injektioner av cDNA konstruktioner i dissocierade vuxen sympatiska nervceller. Denna teknik, som har tillämpats på olika typer av nervceller, framgångsrikt kan framkalla heterologa protein uttryck. Den utrustning som krävs för att mikroinjektion förfarandet ingår ett inverterat mikroskop för att visualisera celler, ett glas injektion pipett fylld med cDNA lösning som är ansluten till en N 2 (g) tryck leveranssystem, och en mikromanipulator. Den mikromanipulator samordnar injektion rörelse mikroinjektion pipett med en kort puls av trycksatta N 2 för att mata ut cDNA lösning från pipettspetsen.
Denna teknik har inte toxiciteten som är förknippad med många andra transfektion metoder och gör att flera DNA-konstruktioner för att komma till uttryck på ett konsekvent förhållande. Det låga antalet injicerade cellerna gör mikroinjektion förfarande lämpar sig väl för enskild cell studier som elektrofysiologiska inspelningar och optisk avbildning, men kan inte vara perfekt för biokemiska analyser som kräver ett större antal celler och högre effektivitet transfektion. Även intranuclear microinjections kräver en investering av utrustning och tid, gör att möjligheten att uppnå höga nivåer av heterologa proteinuttryck i en fysiologiskt relevant miljö denna teknik ett mycket användbart verktyg för att undersöka proteiners funktion.
Vanliga problem och förslag:
Som tidigare nämnts framgångsrika nukleära injektioner beror på att behöva celler anhängare till plattor vävnadskultur. Att skjuta upp starten av injektioner några timmar efter den cell dissociation förfarandet ger nervceller att hålla sig till botten av rätter. Dessutom beläggning rätter med 0,1 mg / ml med hög molekylvikt, poly-L-lysin (Sigma, St Louis, MO) stöd vidhäftning av nervceller till botten yta rätter.
Blockering av mikroinjektion pipetter, speciellt när man försöker injicera en hög koncentration av DNA, kan vara ett vanligt problem. Med hög kolumner kvalitet separation för att isolera och rena plasmid-DNA och utföra de ytterligare reningssteg nämns (spin-filter, spinning av hematokrit tuber) kan hjälpa att ta bort partiklar innan injicering. Under injektioner kan "rena" funktion av trycket injektorn skall användas (0,2 s är tillräckligt), men om det inte löser problemet, bör en ny injektion pipett användas. Om majoriteten av mikroinjektion pipetter bli igensatta under en injektion session överväga att ändra inställningarna i glaset pipett avdragare för att producera tips mikroinjektion pipett med en större öppning.
En annan fråga som uppstår vid kärnkraft injektioner är ojämnheter på undersidan av rätter vävnadskultur. Denna variation påverkar direkt rikta riktigheten av tips injektion pipett till kärnan eftersom djupet i pipett korsar under injektioner är fast. Därför måste detta z-axeln gräns justeras under loppet av injektionerna inom samma maträtt. Det blir tydligt när en justering är nödvändig: blir det ingen indikation på kärnkraft injektion (ingen vit plym i kärnan eller cellen missas helt), eller för insprutning pipettspetsen närmar sig botten av skålen (komprimera cellen eller till och med kraschar pipettspetsen i botten av skålen). Glas-kloning cylindrar (. OD 10 mm, Cat nr 2090-01.010, Bellco Glas, Vineland, NJ) kan användas under plätering av nervceller för att begränsa dem i en mindre, mer begränsat område, därför att minimera avståndet som krävs för att flytta injektionen pipett mellan injektionerna. Dessa kloning cylindrar tas bort innan du utför microinjections.
Nackdelar med tekniken:
Intranuclear microinjections är tekniskt krävande, som kräver tålamod och en hög grad av manuell skicklighet av operatören. Färdighet med denna teknik, som med alla andra färdigheter, kommer med praktik. Därför är det tillrådligt att träna nukleära injektioner av reporter genen ensam innan själva experiment. För att ytterligare underlätta injektionen processen, kan det vara möjligt att konsolidera stegen i mikromanipulator och påtryckningar injektor i ett datorprogram. Program som Igor Pro (WaveMetrics, Portland, OR) kan användas för att lagra mikroinjektion inställningar och programmera multifunktionella styrenheter (ShuttlePRO, Contour Design, Windham, NH) till semi-automatisera injektion processen (se 6,7,8 för detaljer).
En annan nackdel med de intranuclear mikroinjektion tekniken är den låga andelen framgångsrika. Cirka 10-20% av försök till kärnkraft injektioner leda till protein uttryck. Även denna effektivitet kan vara tillräckligt för applikationer som inte kräver ett stort antal uttrycker celler, elektrofysiologi till exempel för olika biokemiska analyser kan detta inte vara tillräckligt.
Tillämpningar av teknik:
Trots sina nackdelar är intranuclear mikroinjektion av DNA en mycket användbar teknik för heterologously uttrycka proteiner i nervceller.
Höga nivåer av proteinuttryck uppnås med kärnvapen microinjections på grund av det stora antalet plasmider ut i kärnan under injektioner, en mycket aktiv CMV promotor som reglerar transkription av gener och långa stabilitet plasmider i kärnan. Protein över-uttryck är särskilt användbart i dominerande-negativa experiment där höga halter av heterologa proteiner som krävs för att överväldiga den endogena proteinet. En annan fördel med intranuclear injektioner är förmågan att leverera en konsekvent del av cDNA konstruktioner till kärnan när flera konstruktioner injiceras. Med andra transfektion metoder är det svårt att reproducerbart införa samma andel av varje DNA bygga in i olika celler inom samma maträtt och mellan transfections. Direkt injektion av cDNA lösning i kärnan eliminerar denna källa till variabilitet och gör förhållandet uttryckt proteiner som ska titered effektivt.
Traditionella transfektion metoder har begränsad effektivitet i post-mitotiska celler på grund av låga inkorporeringen av DNA i cellkärnan 9 och kemisk toxicitet i samband med transfektion REAGmedelsingredienser 10. Kärn microinjections övervinna dessa problem genom att införa genetiskt material mekaniskt in i kärnan. Även om denna teknik är mer engagerade, förmågan att studera effekten av ett protein i en fungerande biologiskt system, komplett med endogena signalvägar, mer än kompenserar för den mödosamma karaktären på denna teknik.
Alla experimentella procedurer på djur har utförts i enlighet med National Institutes of Health: s riktlinjer för djurens skötsel och användning.
Vårt laboratorium forskning stöds av Interna forskningsprogram NIH, National Institute on alkoholmissbruk och alkoholism.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Ultrafree-MC Filter Unit | Millipore | UFC30VV00 | Durapore PVDF filter; 0.1 μm pore-size | |
TE buffer | Quality Biological, Inc | 351-010-131 | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0 | |
Micro-hematocrit capillary tubes | Fisher Scientific | 22-362-574 | Unheparinized Preparation: Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95°C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up. |
|
Microcentrifuge | Eppendorf | 5417 R | With a fixed angle or swinging-bucket rotor | |
Microloader 20 μl pipet tips | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
Microinjection capillary glass | World Precision Instruments | TW120F-4 | Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length | |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | With platinum-iridium box filament (part # FB330B) | |
Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope | Nikon | 20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table | ||
Charge-coupled device (CCD) camera | Cohu Inc. | 6410 | ||
Video monitor | Sony Corporation | PVM-122 | Black and White, 9” screen | |
Micromanipulator system | Eppendorf | 5171 | ||
Microinjection Unit | Eppendorf | FemtoJet Express | ||
Microinjection controller | Contour Design | S-PROV2 | Programmable multimedia controller | |
Igor Pro | WaveMetrics | Version 4.05A | Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda |