Dérivation de cellules souches hématopoïétiques de cellules souches embryonnaires murines
Summary
Ce protocole décrit la dérivation de cellules souches hématopoïétiques transplantables à partir des cellules souches embryonnaires de souris (CES) et leur injection ultérieure dans des souris irradiées de façon létale bénéficiaires. Brièvement, l'ESC sont différenciées comme des corps embryoïdes, qui sont ensuite infectées par HOXB4 rétroviraux et co-cultivées avec des cellules stromales et OP9 cytokines hématopoïétiques.
Abstract
Une cellule souche est définie comme une cellule avec la capacité à la fois à l'auto-renouvellement et de générer de multiples descendance différenciée. Les cellules souches embryonnaires (CSE) sont dérivées de la blastocyste de l'embryon précoce et sont pluripotentes dans la capacité de différenciation. Leur potentiel de différenciation majorité en a fait l'objet de nombreuses recherches centrées sur la façon de les déduire coaxial pour générer des types cellulaires cliniquement utiles. La dérivation réussie de cellules souches hématopoïétiques (CSH) de la souris ESC a récemment été accompli et peuvent être visualisées dans ce protocole vidéo. HSC, sans doute la population cellulaire la plus cliniquement exploitées, sont utilisés pour traiter une multitude de cancers hématopoïétiques et troubles. Toutefois, de nombreux patients qui pourraient bénéficier d'un traitement HSC n'ont pas accès aux bailleurs de fonds appropriés. ESC pourrait fournir une source alternative de HSC pour ces patients. Le protocole suivant établit une base à partir desquelles l'ESC-HSC peuvent être étudiés et les efforts visant à isoler les CSH de CSE humaines. Dans ce protocole, l'ESC sont différenciées comme des corps embryoïdes (EBS) pour 6 jours dans le sérum disponible dans le commerce présélectionnés pour la différenciation hématopoïétique optimale. EB sont alors dissociées et infectés par HOXB4 rétroviraux. Infected EB cellules dérivées sont étalées sur OP9 stroma de la moelle osseuse de cellules stromales dérivées de la ligne de la calvaria de M-CSF / – souris, et co-cultivées en présence de l'hématopoïèse promotion des cytokines pendant dix jours. Lors de cette co-culture, les cellules infectées connaissent une forte expansion, ce qui entraîne la génération d'une piscine hétérogène de 100s de millions de cellules. Ces cellules peuvent ensuite être utilisées à des souris de sauvetage et de reconstituer une irradiation létale.
Protocol
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice | Animal | Taconic Farm | ||
| Plate shaker | Tool | VWR | 33998-360 | Orbital Shaker by Ikaworks |
| Multi-channel pipettor | Tool | VWR | 15000-174 | ePet by BioHit |
| ES trypsin | Reagent | Invitrogen | 15090-046 | 0.25% Trypsin in PBS |
| Standard trypsin | Reagent | Invtrogen | 25300-062 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| PBS | Buffer | Invitrogen | 20012-027 | |
| Enzyme-free dissociation buffer | Buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Dissociation enzyme mix | Buffer | Invitrogen | 17104-019 | 500 mg Collagenase IV |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H2126 | freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing. |
| DNAse | Reagent | Sigma | D4527 | |
| DMEM | Invitrogen | 10-017CV | ||
| Protamine sulfate | Reagent | Sigma | P3369 | 8 ug/mL |
| EB differentiation media | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 10% IMDM | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 10% IMDM+cytokines | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 20% anti-MEM | Please view recipe on attached Protocol.doc |
