Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

Özet

Bu protokol detayları fare embriyonik kök hücreler (ESC) ve ölümcül ışınlanmış alıcı farelere sonraki enjeksiyon transplante hematopoietik kök hücre türetme. Kısaca ESC embriyoid organları, sonra retroviral HoxB4 ve OP9 stromal hücreler ve hematopoetik sitokinlerin birlikte kültürlü ile enfekte olarak ayırt edilirler.

Özet

Bir kök hücre kapasitesine sahip bir hücre olarak tanımlanan, hem kendini yenilemek ve birden fazla farklılaşmış döl oluşturmak. Embriyonik kök hücreler (ESC), erken embriyo blastosist türetilmiştir ve pluripotent differentiative yeteneği vardır. Onların engin differentiative potansiyel klinik olarak yararlı bir hücre türleri oluşturmak için onları nasıl ikna edebilmeyi çözmekten merkezli birçok araştırmanın odak yaptı. Fare ESC hematopoietik kök hücrelerin (HSC) başarılı türetme tamamlanmıştır ve bu video protokolde görüntülendi olabilir. HSC, tartışmasız en çok klinik istismar hücre popülasyonu, hematopoetik maligniteler ve bozukluklar sayısız tedavi etmek için kullanılır. Bununla birlikte, birçok hastada HSC tedaviden yarar olabilir uygun donör erişim yoksundur. ESC, bu hastalar için HSC alternatif bir kaynak sağlayabilir. Aşağıdaki protokol ESC-HSC okudu ve insan ESC HSC izole etmek için çabalar bilgilendirmek edilebileceği bir temel kurar. Bu protokol, ESC, piyasada bulunan serum ön elemeden optimal hematopoetik farklılaşma 6 gün embriyoid organları (EBS) olarak ayırt edilirler. EBS sonra ayrışmış ve retroviral HoxB4 ile enfekte. Fare ve ortak kültür varlığı on gün sitokinler teşvik hematopoez - Enfekte EB-elde edilen hücreler, M-CSF / calvaria türetilmiş bir kemik iliği stromal hücre hattı OP9 stroma kaplanmıştır. Bu ko-kültür sırasında, enfekte olan hücreleri nesil 100'ün üzerinde milyonlarca hücreden heterojen bir havuz, büyük ölçüde genişletmek. Bu hücreler daha sonra kurtarma ve sulandırmak ölümcül ışınlanmış fareler için kullanılabilir.

Protokol

Embriyonik Kök Hücre Farklılaşması

1. ESC tripsin ile tedavi ile embriyonik kök hücreler (ESC) yakın bir konfluent balon toplayın.
2. Farklılaşma medya 5 ml hücreleri yeniden süspanse edin ve olmayan bir-jelatin kaplı T25 transfer. 37 ° C'de 45 dakika için. Süpernatant Al ve santrifüj yoluyla hücreleri toplamak.
   
   Not: ESC kültürlerden gelen Fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) olmayan jelatin kaplı T25 kolayca tutunur ve böylece bu kaplama adımı sırasında kültür tükenmiş. MEFS üzerinde kültür sizin ESC değilseniz, ön-plaka atlayabilirsiniz.
   
   
3. 333.333 cells/50 ml Farklılaşma medyada yeniden süspanse MEF-tüken....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c eksik fareler	Hayvan	Taconic Farm
Plaka çalkalayıcı	Araç	VWR international	33998-360	Ikaworks Orbital Shaker
Çok kanallı pipet	Araç	VWR international	15000-174	BioHit ePet
ES tripsin	Reaktif	Invitrogen	15090-046	PBS içinde %0,25 Tripsin
Standart tripsin	Reaktif	Invitrogen	25300-062	%0,05 Tripsin-EDTA
PBS	Tampon	Invitrogen	20012-027
Enzimsiz disosiasyon tamponu	Tampon	Invitrogen	13151-014
Disosiasyon enzim karışımı	Tampon	Invitrogen	17104-019	500 mg Collagenase IV
Hiyalüronidaz	Reaktif	Sigma-Aldrich	H2126	500 μL'lik alikotlar halinde dondurun ve tekrarlayan dondurma-çözme işlemlerinden kaçının.
DNAz	Reaktif	Sigma-Aldrich	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Protamin sülfat	Reaktif	Sigma-Aldrich	P3369	8 μg/mL
EB diferansiyasyon ortamı	ortam			Lütfen ekli Protocol.doc dosyasındaki tarife bakınız
%10 IMDM	ortam			Lütfen ekli Protocol.doc dosyasındaki tarife bakınız
%10 IMDM+sitokinler	ortam			Lütfen ekli Protocol.doc dosyasındaki tarife bakınız
%20 anti-MEM				Lütfen ekli Protocol.doc dosyasındaki tarife bakınız