이 프로토콜은 염료가 조정 해상도 등 기니 돼지 장용 신경계의 plexuses으로 손상 신경망에서 전기 활동의 광학 녹음을 활성화하는 방법 전압에 민감한 개념 단일 세포에서 다중 ganglionic 회로 등을 꼽을 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
장용 신경계 (팔)는 격리 복잡한 행동을 수행하는 능력이 확인된 기능과 자체 네트워크를 포함하고 있습니다. 그 뉴런은 (직경 10-25 μm의) 창자 벽의 별개의 비행기를 역사는 plexuses에 배열되어
프로토콜
1 부 : 조직 준비
- submucous 및 myenteric 신경 얼기 준비는 1백50-2백g (이전 2-3주) isoflurane 흡입과 참수하여 anesthetized되었습니다 하틀리 기니 돼지 작은 창자에서 연속적인 절개로 절연하고 있습니다. 안락사 후, 소장은 excised과 내용은 따뜻하고, 산소 솔루션 루멘 플러싱에 의해 제거됩니다. 우리는 25 MM HEPES, 37 미리 예열되어 7.4 (M199 - DM으로, 지금부터 함) 조정 5 MM NaHCO 3 2 MM의 글루타민, 그리고 산도, ° C.와 보충 중간 199 사용 프로토콜의 모든 나머지 단계는 그러나, 상온에서 실시한다.
- 창자 세그먼트 길이 80-10센티미터은 mesenteric 경계 오픈 M199 - DM을 포함하는 Sylgard 요리로 전송하고, 곤충 핀을 사용하여 점막 측면까지 마운트됩니다. 그것은 달아 후 조직이 정기적으로 정렬 점막 villi의 행을 가진 직사각형 모양을 전시 있도록도 긴장을 유지하기 위해 매우 중요합니다.
- 스트레이트 팁을 잘 더몬트 집게를 사용하여, 거의 수평 위치에서 그것은 쉽게 준비 중 한 끝에 villi를 잡을과 조직의 세로 축을 따라 거리에 당겨 점막 껍질. 샘플이 균일하게 고정된 경우, 점막의 리본은 subm....
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토론
이 프로토콜은 두 가지 목표를 염두에두고 작성되었습니다. 첫 번째는 지난 10의 다양한 기술 발전, 전압에 민감한 염료를 사용하는 전기 활동의 광학 녹음 덕분에 그대로의 연결 네트워크를 공부에 대해 가장 강력하고, 안정적이고 저렴한 방법 중 하나가 있으며, 다른 조사를 설득하는 것입니다, 정말 그것은 쉽게 겸손한 자원을 가지고 실험실에서도 구현할 수 있습니다. 두 번째 목표는 두 가지의 연결 plexuses 및 생물 학적 출력의 전기적 동작과 분자 및 세포 이벤트를 상호 연관시킬하는 독특한 실험 모델로 장용 신경계를 촉진하는 것입니다.
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감사의 글
우리는 우리와 함께 자신의 기술 전문 지식을 공유에 대한 2 광자 영상의 시작 부분에 표시되는 이미지, H. 다카노를 얻기위한 자신의 2 광자 현미경을 사용하는 허용을위한 검찰 쿨터 (들어온다) 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M3769 | Earle’s salts 포함, L-Glutamine, Phenol Red 및 Sodium Bicarbonate 제외 |
| Sylgard | Dow Corning | 184 silicone elastomer kit | |
| 해부용 곤충 핀 | F.S.T. | 26001-30 | |
| Dumont 핀셋 | F.S.T. | 11203-23 또는 11200-33 | |
| Moria MC19/B Pascheff-Wolff 스프링 가위 | F.S.T. | 15371-92 | |
| 실험 중 조직 고정용 핀 | Seirin Corp. | Seirin Spinex | |
| Collagenase VII | Sigma-Aldrich | C0773 | |
| Protease IX | Sigma-Aldrich | P6141 | |
| 소태아 혈청 (Fetal Bovine Serum) | Invitrogen | 10439-016 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| L-Glutamine 100X | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Nifedipine | Sigma-Aldrich | ||
| Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Life Technologies | D36802 | |
| 4채널 자극 발생기 | Multi Channel System MCS GmbH | 2000 Series | |
| 연동 펌프 | Rainin | 2-channel Dinamax RP-1 | |
| 고속 카메라 | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| 1:10 축소기 / 릴레이 렌즈 | Optem, Qioptiq Inc. | ||
| 정립 현미경 | Olympus Corporation | BX61TRF | |
| 전동 X-Y 이동 장치가 포함된 Gibraltar 고정 스테이지 | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada | PSSG--BX2 | |
| 선형 매트릭스 전극 | FHC, Inc. | 주문 제작 | |
| 능동형 진동 절연 테이블 | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | |
| 초저 리플 피드백 안정화 전원 공급 장치 | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | |
| 열 필터 | Schott AG | KG-1 | |
| High-Q 간섭 필터 | Chroma Inc. | HQ530/50 | |
| 다이크로익 미러 | Chroma Inc. | 565 nm (투과율 50%) | |
| 롱패스 필터 | Chroma Inc. | HQ572LP | |
| 방음 커튼 | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | |
| Neuroplex | RedShirtImaging, LLC | ||
| IDL | ITT Visual Information Solutions | ||
| 전용 카메라 컨트롤러가 포함된 고해상도 CCD 카메라 | Hamamatsu Corp. | ||
| 고해상도 카메라용 프레임 그래버 | Data Translation | DT3120K-1 | |
| 고해상도 카메라용 이미징 소프트웨어 | Data Translation | Global Lab Image/2 |
참고문헌
- Johnson, L. eonard R. in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , Raven Press. New York. 1-1 (1987).
- Obaid, A. L. Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell....
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재인쇄 및 허가
