Organotypic murine रेटिनल Wholemount संस्कृति vivo की तरह
Summary
यह वीडियो लेख organotypic रेटिना wholemount संस्कृतियों और exogenously प्रेरित प्रभाव के विश्लेषण के लिए एक cytospin प्रक्रिया की स्थापना को दर्शाता है. Organotypic रेटिना wholemount संस्कृतियों की नकल<em> Vivo में</em> स्थिति और काफी प्रयोगात्मक अभिव्यक्ती लिए murine retinas की पहुंच की सुविधा, जबकि शास्त्रीय murine पशु मॉडल का नुकसान circumventing.
Abstract
पशु मॉडल और जीन विश्लेषण के लक्षित ablations दाखिला विशिष्ट रेटिना जीन समारोह के लिए शास्त्रीय रणनीति है. हालांकि, ट्रांसजेनिक, रेटिना विशेष या सशर्त पीटकर माउस मॉडल अक्सर जल्दी मारक प्रदर्शित करने या गंभीर विरूपताओं से ग्रस्त हैं, भ्रूण या जल्दी प्रसवोत्तर चरणों से परे एक विश्लेषण को रोकने.
प्राथमिक सेल संस्कृति exogenously लागू पुनः संयोजक कारक है, एक नियंत्रित वातावरण में या siRNA की मध्यस्थता जीन पछाड़ना जीन की overexpression के प्रभाव की जांच के लिए एक विकल्प है. Dissociated सेल संस्कृति लाभ है कि अंतर्जात लक्ष्य कोशिकाओं तक पहुँचने के संकेतों को कम कर रहे हैं, जिससे औषधीय हेरफेर के बाद exogenously ट्रिगर प्रभाव की पहचान की सुविधा. हालांकि, महत्वपूर्ण सेल सेल बातचीत शुरू enzymatic पाचन या यांत्रिक हदबंदी द्वारा नष्ट कर रहे हैं, भले ही फिर से एकत्रित retinospheroid 1 संस्कृतियों का इस्तेमाल कर रहे हैं.
इसके विपरीत करके, organotypic रेटिना wholemount संस्कृतियों neuronal बातचीत और कनेक्शन अभी भी संरक्षित 2-5 के साथ vivo स्थिति में एक शारीरिक के लिए करीब प्रणाली प्रदान करते हैं .
इस वीडियो लेख में हम (1) organotypic भ्रूण प्रसव के बाद, और वयस्क murine आँखों के विच्छेदन के peculiarities और (2) के विश्लेषण के लिए एक neuronal की हदबंदी और cytospin प्रक्रिया सहित रेटिना wholemount संस्कृतियों की तरह vivo में की स्थापना के कदम प्रदर्शन के द्वारा एक कदम प्रदान apoptosis और organotypic wholemounts में रेटिना सेल प्रसार, exogenously लागू रीकॉम्बीनैंट कारकों की उपस्थिति में संस्कृति के बाद उदा.
Protocol
Discussion
पृथक्करण, monolayer अधिक murine organotypic रेटिना wholemount संस्कृतियों 2-5, retinospheroid या फिर से एकत्रित 3D उपगोल संस्कृतियों 1 neuronal बातचीत और कनेक्शन के संरक्षण में निहित है, का लाभ vivo स्थिति में नकल उतार. पूर्व 2 रि?…
Acknowledgements
लेखकों organotypic संस्कृतियों और तकनीकी सहायता के लिए अमेरिकी Laub और अमेरिकी Gerster की स्थापना के साथ मदद के लिए प्रारंभिक ई. डे ला रोजा और एअर इंडिया Valenciano धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
| Dissection microscope | Tool | ZEISS | ||
| PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham | Reagent | Sigma | D 8900 | DMEM / F-12 |
| Apo-transferin | Reagent | Sigma | T 1147 | |
| Putrescin | Reagent | Sigma | P 5780 | |
| Sodium selenite | Reagent | Sigma | S 9133 | |
| Progesterone | Reagent | Sigma | P 6149 | |
| Gentamicine | Reagent | Invitrogen | ||
| L-Glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-024 | 200 mM (100X), liquid |
| Bovine serum albumine (BSA) | Reagent | Roth | 8076.3 | 30 mg/ml |
| Collagenase | Reagent | Sigma | C 0773 | 200 U/ml |
| Trypsin | Reagent | Sigma | T4799 | From porcine pancreas; 1 mg/ml |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H 3884 | 200 mg/ml |
| DNase I | Reagent | Roche | 1 284 932 | 10 mg/ml |
| EDTA | Reagent | Sigma | E 6511 | |
| Silicone solution | Reagent | Serva | 35130 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Reagent | Sigma | P6148 | 8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4). |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Reagent | Sigma | D 0542 | DAPI |
| Fluorescent Mounting Medium | Reagent | Dako | S3023 | |
| BrDU | Reagent | Sigma | B 9285 | |
| 96-well plates | Tool | FALCON | 3072 | |
| 24-well plates | Tool | FALCON | 3047 | |
| Pasteur pipettes | Tool | Brand | 747720 | |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors,straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin | |
| Cooling centrifuge | Tool | Eppendorf | ||
| Rotation shaker | Tool | CAT | ||
| Cytospin | Tool | Thermo Scientific |
References
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- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).
- Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina. Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).
- Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death. J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).
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