Dissecação ao vivo de Drosophila Embriões: Métodos ágeis para Screening Coleções Mutant pela coloração de anticorpos
Summary
Nós descrevemos um protocolo simplificado para a geração de "filé" preparações de embriões Drosophila de genótipos específicos. Este protocolo permite a execução eficiente de uma variedade de telas genética. Ele também permite excelente visualização das estruturas do embrião tarde.
Abstract
Embriões Drosophila entre os estágios 14 e 17 do desenvolvimento embrionário pode ser facilmente dissecados para gerar "filé" preparativos. Nessas preparações, o sistema nervoso central funciona abaixo do meio, e é ladeado por paredes corpo. Muitos fenótipos diferentes foram examinados usando tais preparações. Na maioria dos casos, os filés foram gerados por meio de dissecção de anticorpos manchada fixo todo mount-embriões. Estes "dissecções fixo" têm algumas desvantagens, no entanto. Eles são demorados para executar, e é difícil de classificar mutante (GFP-negativo) embriões de ações em que as mutações são mantidos ao longo cromossomos balanceador de GFP. Desde 2002, nosso grupo vem realizando deficiência e telas de expressão ectópica de identificar ligantes de receptores órfãos. A fim de fazer isso, desenvolvemos protocolos simplificados para dissecção embrião vivo e coloração de anticorpos de coleções contendo centenas de linhas balanceadas. Concluímos que é consideravelmente mais eficiente para analisar fenótipos em grandes coleções de stocks por dissecção ao vivo do que pela dissecção fixo. Utilizando o protocolo descrito aqui, um único indivíduo treinado pode tela de até 10 linhas por dia para fenótipos, examinando 4-7 embriões mutantes de cada linha em um microscópio composto. Isto permite a identificação de mutações conferindo sutil, de baixa penetrância fenótipos, uma vez que até 70 hemisegments por linha são marcados em grandes ampliações com uma lente de imersão em água 40X.
Protocol
Discussion
Desejamos que este vídeo de demonstração tem apresentado os nossos métodos para dissecção embrião vivo e coloração em detalhes suficientes para que eles agora podem ser facilmente executados por qualquer pessoa que tenha alguma experiência em Drosophila genética e da embriologia. É claro, a prática ainda será necessário, principalmente para as dissecações si. Em nossa experiência, cada pessoa que aprende os métodos de dissecação ao vivo irá criar um protocolo de dissecação sutilmente dif…
Acknowledgements
Agradecemos a Nicki Fox e Aloisia Schmid por suas contribuições para o desenvolvimento destes protocolos. Este trabalho foi financiado por um RO1 NIH conceder a KZ, NS28182.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Borosilicate Tubing With Filament | Sutter Instrument | BF120-60-10 | ||
| Narishige model PC-10 needle puller | Narishige | Tubes pulled using a heater level of 58.9 |
References
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Desai, C. J., Gindhart, J. G., Goldstein, L. S., Zinn, K. Receptor tyrosine phosphatases are required for motor axon guidance in the Drosophila embryo. Cell. 84, 599-609 (1996).
- Sun, Q., Schindelholz, B., Knirr, M., Schmid, A., Zinn, K. Complex genetic interactions among four receptor tyrosine phosphatases regulate axon guidance in Drosophila. Molecular and cellular neurosciences. 17, 274-291 (2001).
- Schmid, A., Schindelholz, B., Zinn, K. Combinatorial RNAi: a method for evaluating the functions of gene families in Drosophila. Trends in neurosciences. 25, 71-74 (2002).
- Fox, A. N., Zinn, K. The heparan sulfate proteoglycan syndecan is an in vivo ligand for the Drosophila LAR receptor tyrosine phosphatase. Curr Biol. 15, 1701-1711 (2005).
