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Dissecação ao vivo de Drosophila Embriões: Métodos ágeis para Screening Coleções Mutant pela coloração de anticorpos

DOI:

10.3791/1647

December 29th, 2009

In This Article

Summary

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Nós descrevemos um protocolo simplificado para a geração de "filé" preparações de embriões Drosophila de genótipos específicos. Este protocolo permite a execução eficiente de uma variedade de telas genética. Ele também permite excelente visualização das estruturas do embrião tarde.

Abstract

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Embriões Drosophila entre os estágios 14 e 17 do desenvolvimento embrionário pode ser facilmente dissecados para gerar "filé" preparativos. Nessas preparações, o sistema nervoso central funciona abaixo do meio, e é ladeado por paredes corpo. Muitos fenótipos diferentes foram examinados usando tais preparações. Na maioria dos casos, os filés foram gerados por meio de dissecção de anticorpos manchada fixo todo mount-embriões. Estes "dissecções fixo" têm algumas desvantagens, no entanto. Eles são demorados para executar, e é difícil de classificar mutante (GFP-negativo) embriões de ações em que as mutações são mantidos ao longo cromossomos balanceador de GFP. Desde 2002, nosso grupo vem realizando deficiência e telas de expressão ectópica de identificar ligantes de receptores órfãos. A fim de fazer isso, desenvolvemos protocolos simplificados para dissecção embrião vivo e coloração de anticorpos de coleções contendo centenas de linhas balanceadas. Concluímos que é consideravelmente mais eficiente para analisar fenótipos em grandes coleções de stocks por dissecção ao vivo do que pela dissecção fixo. Utilizando o protocolo descrito aqui, um único indivíduo treinado pode tela de até 10 linhas por dia para fenótipos, examinando 4-7 embriões mutantes de cada linha em um microscópio composto. Isto permite a identificação de mutações conferindo sutil, de baixa penetrância fenótipos, uma vez que até 70 hemisegments por linha são marcados em grandes ampliações com uma lente de imersão em água 40X.

Protocol

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Introdução

Embriões Drosophila entre os estágios 14 e 17 do desenvolvimento embrionário pode ser facilmente dissecados para gerar "filé" preparativos. Nessas preparações, o sistema nervoso central (SNC) é executado no meio, e é ladeado por paredes corpo. O intestino é removida. Quando corados com anticorpos, filetes de permitir a visualização muito melhor do CNS e estruturas do corpo de parede (axônios motores, por exemplo, músculos periféricos sensoriais (PNS) neurônios, traquéias) do que montar todo-embriões, porque não há nenhum tecido intermediário entre a preparação ea lamela, e porque filetes são planas, permitindo q....

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Discussion

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Desejamos que este vídeo de demonstração tem apresentado os nossos métodos para dissecção embrião vivo e coloração em detalhes suficientes para que eles agora podem ser facilmente executados por qualquer pessoa que tenha alguma experiência em Drosophila genética e da embriologia. É claro, a prática ainda será necessário, principalmente para as dissecações si. Em nossa experiência, cada pessoa que aprende os métodos de dissecação ao vivo irá criar um protocolo de dissecação sutilmente diferente que permite que e.......

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Acknowledgements

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Agradecemos a Nicki Fox e Aloisia Schmid por suas contribuições para o desenvolvimento destes protocolos. Este trabalho foi financiado por um RO1 NIH conceder a KZ, NS28182.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubulação de borosilicato com filamento Sutter Instrument Co.BF120-60-10
Narishige modelo PC-10 extrator de agulhasNarishige InternationalTubes puxados usando um nível de aquecedor de 58,9

References

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  1. Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
  2. Desai, C. J., Gindhart, J. G., Goldstein, L. S., Zinn, K.

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Drosophila Embryo DissectionLive Embryo StainingAntibody Staining ProtocolMutant Line ScreeningGFP Balancer ChromosomesCompound Microscopy AnalysisWax Rectangle SlideDouble Sided TapeGrape Agar PlateImmunofluorescence Microscopy

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