الإلتقام ينظم ينظم مستويات التعبير سطح الخلية لمعظم البروتينات الغشاء. هنا نستخدم اختزال والكواشف غشاء biotinylation impermeant لقياس معدل التقامي للنقل الدوبامين (DAT) ، وهو بروتين الغشاء polytopic. الأسلوب يسهل نهج مباشرة لقياس معدل التقامي معظم البروتينات غشاء البلازما.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس معدلات بلازما بروتين الغشاء التقامي بواسطة Biotinylation عكسية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
بروتينات غشاء البلازما هي كبيرة ، مجموعة متنوعة من البروتينات تتكون من المستقبلات ، وقنوات ايون وشركات النقل والمضخات. نشاط هذه البروتينات هي المسؤولة عن مجموعة متنوعة من الأحداث الخلوية الأساسية ، بما في ذلك تسليم المواد الغذائية ، واستثارة الخلوية ، وإشارات كيميائية. ويتم تنظيم العديد من البروتينات بشكل حيوي غشاء البلازما من الاتجار التقامي ، الذي ينظم وظيفة البروتين البروتين التعبير عن طريق تغيير السطح. الآليات التي تسهل الإلتقام البروتين معقدة وغير مفهومة تماما عن بروتينات غشاء كثيرة. لكي نفهم تماما الآليات التي تتحكم في الاتجار التقامي من بروتين معين ، فمن الأهمية بمكان أن يتم قياسها بدقة نسبة البروتين التقامي ق. لمستقبلات عديدة ، كثيرا ما يتم تحقيق معدل القياسات المباشرة التقامي باستخدام مستقبلات يغاندس المسمى. ومع ذلك ، لفئات كثيرة من البروتينات الغشاء ، مثل النقل ، ومضخات وقنوات أيون ، ليس هناك يجند مريحة والتي يمكن استخدامها لقياس معدل التقامي. في هذا التقرير ، ونحن تصف طريقة biotinylation عكسها التي نستخدمها لقياس نقل الدوبامين (DAT) معدل التقامي. هذا الأسلوب يوفر نهجا واضحة لقياس معدلات الاستيعاب ، ويمكن استخدامها بسهولة لدراسات الاتجار معظم البروتينات الغشاء.
البروتوكول
إجراء لمحة عامة :
باستخدام هذا النهج ، وصفت تساهميا بروتينات سطح الخلية مع البيوتين على بقايا يسين المتاحة خارج الخلية باستخدام impermeant الغشاء ، ثاني كبريتيد ، بالإضافة كاشف biotinylation (سلفو - NHS - SS - البيوتين) تحت شروط تقييدية الاتجار (أي درجة حرارة منخفضة) (انظر الشكل 1 من أجل التوضيح). هو تحول مجموعة واحدة من الخلايا لشروط متساهلة الاتجار (37 درجة مئوية) واستيعاب البروتينات biotinylated. تبقى مجموعة أخرى من الخلايا في درجة حرارة منخفضة تصل إلى ضوابط ل1) سطح البروتين الكلي في الوقت = 0 ، و 2) السيطرة تجريد. بعد فترة قصيرة من استيعاب ، وتحول الخلايا مر....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
المشاكل الشائعة : المشكلة الأكثر شيوعا التي تنشأ في هذه التجارب هو ضعف كفاءة القطاع. كفاءة قطاع حاسم في أن تكون قادرة على تفسير النتائج. إلا إذا كان الشريط كفاءة عالية ، فإنه ليس من الممكن أن نستنتج أن أي البروتينات biotinylated في الممرات استيعاب كانت ، في الواقع ، المنضوية من السطح. شرائط الكفاءة ≥ 90 ٪ هي الأمثل ، ونحن تجاهل أي نتائج إذا كان الشريط يندرج تحت هذا المستوى. ويرد مثال على الشريط الفقراء في الشكل 3. علما أن الفرقة في حارة الشريط غير واضح تماما ، ويناظر كفاءة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح # DA15169 من HEM
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المراجع
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
