ويتجلى طريقة لعزل أنواع معينة من الخلايا من المواد النباتية. تستخدم هذه التقنية خطوط علامة المعدلة وراثيا في التعبير عن البروتينات الفلورية أنواع الخلايا وجه الخصوص ، والإسفار الخلوية تفارق الفرز الخلية المنشط. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تأسيس الإعداد النمو هنا تسهل علاج thaliana Arabidopsis الشتلات قبل الفرز الخلية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مضان الفرز الخلية النباتية المنشط من Protoplasts
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
عالية الدقة ، الخلية نوع معين من تحليل التعبير الجيني يحسن إلى حد كبير فهم التنظيم التنموية والاستجابة للمؤثرات البيئية في أي كائن متعدد الخلايا. التهجين في الموضع والتصور مراسل الجين يمكن إلى حد محدود يمكن استخدامها لهذه الغاية ولكن لارتفاع القرار الكمي RT - PCR أو الإنتاجية العالية transcriptome على نطاق التحليل عزل الحمض النووي الريبي من أنواع الخلايا معين هو المطلوب. تفكك النسيج الخلوي معربا عن علامة بروتين فلوري في نوع من الخلايا المحددة واللاحقة الإسفار الفرز الخلية المنشط (FACS) يجعل من الممكن لجمع كميات كافية من المواد اللازمة لاستخراج الحمض النووي الريبي ، [كدنا] توليف / ميكروأري التضخيم والتحليل.
مجموعة واسعة من الخلايا نوع محدد خطوط مراسل الفلورسنت يتوفر لمحطة المجتمع البحثي. في هذه الحالة ، يتم استخدام خطوط علامة اثنين من الجذر thaliana Arabidopsis : P SCR : : GFP (endodermis ومركز هادئة) و ف WOX5 : GFP (وسط هادئة). تزرع بأعداد كبيرة (آلاف) من الشتلات hydroponically أو على لوحات أجار وحصادها للحصول على ما يكفي من المواد الجذرية لمزيد من التحليل. ويتحقق الخلوية تفارق من المواد النباتية التي الهضم الأنزيمية للجدار الخلية. هذا الإجراء يجعل من استخدام الأسمولية انفكاك الجبلة التي يسببها ارتفاع والسليلوزات المتاحة تجاريا ، وpectinases hemicellulases للافراج عن protoplasts الى حل.
FACS من GFP إيجابية الخلايا يستفيد من التصور الأخضر مقابل الانبعاثات الأطياف الحمراء protoplasts ولع ليزر 488 نانومتر. ويمكن تمييز ايجابي GFP protoplasts التي زادت نسبتهم من الأخضر إلى الأحمر الانبعاثات. عادة يتم فرز Protoplasts مباشرة في استخراج الحمض النووي الريبي العازلة وتخزينها لمزيد من المعالجة في وقت لاحق.
وكشفت هذه التقنية لتكون واضحة وقابلة للتنفيذ. علاوة على ذلك ، تبين أنه يمكن استخدامه دون صعوبة لعزل أعداد كافية من الخلايا لتحليل transcriptome ، حتى بالنسبة لأنواع الخلايا نادرة جدا (مثل خلايا مركز هادئة). وأخيرا ، أظهرت الإعداد لنمو الشتلات Arabidopsis المعاملة غير معقدة تمكن من النباتات قبل الفرز الخلية (على سبيل المثال لنوع محدد من الخلايا تحليل استجابات التوتر الحيوية أو غير الحيوية). تكميلي محتمل يستخدم لمراقبة الأصول الميدانية من محطة protoplasts تمت مناقشتها.
البروتوكول
1) إعداد المواد النباتية
- يمكن استخلاص العديد من Protoplasts الأنواع النباتية المختلفة والأنسجة شريطة استخدام المزيج الصحيح من جدار الخلية الانزيمات هضم 1. قبل إجراء تجربة على نطاق واسع ، والهضم الصغيرة من المواد ينصح من أجل تقييم كفاءة protoplasting من الأنسجة ، والانزيمات وغيرها ، وعلى تقدير إيجابي الخلايا في المئة لفرز الخلايا. هنا ، protoplasts المشتقة من جذور الشتلات thaliana Arabidopsis تلك الخلية من نوع خاص تستخدم تعبير الخضراء بروتين فلوري (GFP). يتم وضع علامة على endodermis وهادئة من قبل مركز SCR....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن Protoplasts من حيث المبدأ ، يمكن أن تستمد من مجموعة متنوعة من الأنسجة النباتية ، وتحسين الظروف المواتية سوف يعزز كثيرا نوعية وكمية الحمض النووي الريبي. سيكون كل من حل protoplasting وحضانة الانتخابية العازلة المستخدمة تؤثر على هذا الجانب.
ويمكن استخدام العديد من البروتينات الفلورية مختلفة ، اعتمادا على قدرات استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية ، على سبيل المثال GFP ، RFP ، YFP ، CFP أو المتغيرات الك.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية (منحة رقم 0519984 DBI) ، والمعاهد الوطنية للصحة (منحة لا. 5R01GM078279)..
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| شبكة نايلون μm 250 | Sefar Filtration | NITEX 03-250/50 | |
| شبكة نايلون μm 100 | Sefar Filtration | NITEX 03-100/47 | |
| أطباق بتري مربعة | Fisher Scientific | 08-757-10k | |
| أطباق زراعة نباتية (Phytatrays) | Sigma-Aldrich | P1552 | |
| وسط موراشيغ وسكوغ الأساسي (MS) | Sigma-Aldrich | M5519 | |
| سكروز | Fisher Scientific | S5-3 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | محلول مخزون 10 M |
| مجهر Eclipse 90i | Nikon Instruments | ||
| Cellulase R-10 | Yakult Pharmaceutical | ||
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical | ||
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | M9546 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P8041 | محلول مخزون 1 M |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| β-mercapt–thanol | Calbiochem | 444203 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C2536 | محلول مخزون 1 M |
| هزاز مداري | Labline Instruments | ||
| مصفاة خلايا μm 40 | BD Biosciences | 352340 | |
| أنابيب مخروطية 15 ml | BD Biosciences | 352196 | |
| جهاز طرد مركزي مكتبي | Sorvall, Thermo Scientific | Legend RT | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| FACSAria | BD Biosciences | ||
| أنابيب طرد مركزي دقيقة 1.5 ml | VWR international | 20170-38 | |
| طقم RNeasy micro | Qiagen | 74004 | |
| نظام WT-Ovation Pico لتضخيم RNA | NuGEN | 3300_12 | |
| وحدة FL-Ovation cDNA Biotin الإصدار V2 | NuGEN | 4200_12 |
المراجع
- Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 127, 1466-1475 (2001).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a r....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
