Neuronal सिस्टम में गतिविधि अक्सर एक विशिष्ट जनसंख्या के भीतर न्यूरॉन्स से तुल्यकालिक कार्रवाई संभावित निर्वहन की आवश्यकता है. उदाहरण के लिए, दालों के हार्मोन (GnRH) gonadotropin रिहा संभावना GnRH न्यूरॉन्स के बीच समन्वित गतिविधि की आवश्यकता है. हम मज़बूती से diffusely वितरित GnRH न्यूरॉन्स से युगपत electrophysiological रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए हमारी methodological दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं.
Gonadotropin – विमोचन हार्मोन (GnRH) एक छोटे से neuropeptide कि luteinizing हार्मोन (LH) और कूप उत्तेजक हार्मोन (FSH) के पिट्यूटरी रिलीज को नियंत्रित करता है. ये गोनैडोट्रॉपिंस प्रजनन समारोह के विनियमन के लिए आवश्यक हैं. GnRH युक्त न्यूरॉन्स diffusely hypothalamus और मंझला श्रेष्ठता के लिए परियोजना भर में वितरित कर रहे हैं जहां वे अपने अक्षतंतु टर्मिनलों से hypophysiotropic पोर्टल प्रणाली (1) में GnRH रिहाई. पोर्टल capillaries में GnRH पूर्वकाल पिट्यूटरी ग्रंथि के लिए यात्रा करने के लिए प्रणालीगत संचलन में गोनैडोट्रॉपिंस की रिहाई को प्रोत्साहित. GnRH रिलीज निरंतर है, लेकिन नहीं है, बल्कि प्रासंगिक दालों में होता है. यह अच्छी तरह से स्थापित है कि GnRH रिलीज के आंतरायिक तरीके प्रजनन (2, 3) के लिए आवश्यक है.
एकाधिक GnRH शायद न्यूरॉन्स underlies GnRH दालों की गतिविधि का समन्वय. GnRH न्यूरॉन्स में कुल पेप्टाइड सामग्री 1.0 लगभग स्नातकोत्तर / (4) सेल, जिसमें से 30% की संभावना Releasable पूल शामिल हैं. एक पल्स के दौरान GnRH (5, 6) के स्तर का सुझाव है, कई GnRH न्यूरॉन्स शायद neurosecretion में शामिल हैं. इसी तरह, एकल इकाई गतिविधि LH रिलीज के दौरान hypothalamic बहु इकाई रिकॉर्डिंग से निकाले इंगित करता है कई न्यूरॉन्स (7) की गतिविधि में परिवर्तन. LH दालों के दौरान दर्ज की गतिविधि के साथ इलेक्ट्रोड या तो GnRH somata या फाइबर (8) के साथ जुड़े रहे हैं. इसलिए, इस गतिविधि के कम से कम कुछ GnRH न्यूरॉन्स से उठता है.
तंत्र है कि hypothalamic GnRH न्यूरॉन्स में सिंक्रनाइज़ फायरिंग में परिणाम अज्ञात है. Elucidating कि GnRH न्यूरॉन्स में फायरिंग समन्वय तंत्र एक जटिल समस्या है. सबसे पहले, GnRH न्यूरॉन्स अपेक्षाकृत संख्या में कुछ कर रहे हैं. कृन्तकों में, वहाँ 800-2500 GnRH न्यूरॉन्स हैं. यह स्पष्ट नहीं है कि सभी GnRH न्यूरॉन्स प्रासंगिक GnRH रिलीज में शामिल हैं. इसके अलावा, GnRH न्यूरॉन्स diffusely (1) वितरित कर रहे हैं. इस फायरिंग के समन्वय की हमारी समझ जटिल है और कई तकनीकी दृष्टिकोण असभ्य बनाया. हम कार्रवाई क्षमता के प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए वर्तमान दबाना मोड में ढीला सेल संलग्न रिकॉर्डिंग अनुकूलित है और एक रिकॉर्डिंग दृष्टिकोण है कि GnRH न्यूरॉन्स के जोड़े से युगपत रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है विकसित.
GnRH न्यूरॉन्स (हार्मोन स्राव के आधार पर) सहित कुछ न्यूरॉन्स में ब्याज की गतिविधि घंटे का समय तराजू (5-7) पर होता है. इसलिए, पूरे सेल विन्यास कुछ प्रयोगात्मक पूरे सेल रिकॉर्डिंग मोड में intracellular दूत के डायलिसिस की वजह से लक्ष्य के लिए सबसे अच्छा विकल्प नहीं है. Secondarily, पूरे सेल रिकॉर्डिंग आम तौर पर कम उम्र के बारे में 120 दिनों की तुलना में पशुओं के लिए सीमित कर रहे हैं. उम्र के साथ, neuronal झिल्ली के लिए ठोस बनाना, उच्च प्रतिरोध मुश्किल से हासिल जवानों बनाने दिखाई देते हैं. इसके अतिरिक्त, एक अगर एक उच्च प्रतिरोध मुहर प्राप्त है, rupturing पैच मुहर बाधित, पिपेट और झिल्ली के बीच एक छेद छोड़ने. यह एक व्यर्थ रिकॉर्डिंग और एक न्यूरॉन है कि जल्दी से ईओण असंतुलन के कारण मर जाएगा की ओर जाता है है. नियमित रूप से डिम्बग्रंथि के चक्र और इस प्रकार, GnRH पल्स जनरेटर के स्थिर गतिविधि के बाद के जीवन में जब तक नहीं होती (C57Bl6 महिलाओं में उम्र के 7-10 महीने, 11, 12), उम्र के परे जब एक यथोचित पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्राप्त करने की आशा कर सकते हैं मज़बूती से. अंत में, पूरे सेल रिकॉर्डिंग आंतरिक और बाह्य आयन सांद्रता के अंतर्जात अनुपात को नष्ट. पूरे सेल रिकॉर्डिंग के साथ, किसी भी आयन एकाग्रता आंतरिक विंदुक समाधान में आयन की एकाग्रता के बराबर होती है . यह है क्योंकि विंदुक समाधान है अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में तेजी से संतुलन तक पहुँच के साथ / अपेक्षाकृत छोटे सेल के अंतर्जात मात्रा की जगह है.
ढीले सेल संलग्न दृष्टिकोण पूरे सेल रिकॉर्डिंग की सीमाओं के कई circumvents. सबसे पहले, एक कम प्रतिरोध मुहर (15-30 MΩ) इस्तेमाल किया जा सकता है. ये अपेक्षाकृत आसान बड़े जानवरों से न्यूरॉन्स में भी फार्म कर रहे हैं. दूसरे, एक झिल्ली टूटना सील पैच नहीं करता है. इसलिए, ढीला सेल संलग्न रिकॉर्डिंग तकनीकी पूरे सेल रिकॉर्डिंग की तुलना में आसान हैं. इसके अतिरिक्त, के बाद से कोशिका झिल्ली बरकरार है, intracellular घटकों का डायलिसिस हो और अंतर्जात ईओण का अनुपात संरक्षित कर रहे हैं नहीं करता है. एक ढीला सेल संलग्न दृष्टिकोण synaptic धाराओं के अध्ययन के लिए नहीं का उपयोग करें, लेकिन यह एक अपेक्षाकृत गैर इनवेसिव तरीके से न्यूरॉन्स से लंबी अवधि के रिकॉर्डिंग के लिए आदर्श है. सेल संलग्न रिकॉर्डिंग भी पिपेट में किसी भी मानक intracellular समाधान का उपयोग किया जा सकता है. यह झिल्ली पैच rupturing जब लंबे समय तक रिकॉर्डिंग पूरा हो गया है और एक intracellular मार्कर के साथ न्यूरॉन लेबलिंग का अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है.
ढीला सेल संलग्न दृष्टिकोण वोल्टेज क्लैंप रिकॉर्डिंग मोड में प्रयोग किया गया है. हालांकि, ढीला सेल संलग्न विन्यास में वोल्टेज क्लैंप रिकॉर्डिंग कई methodological समस्याओं है. सबसे पहले, संकेत दर्ज गतिविधि के एक अप्रत्यक्ष उपाय है. संकेत है कि (के रूप में मौजूदा कार्रवाई तथाकथित) मापा जाता है capacitive वर्तमान है कि झिल्ली (13) का प्रभार है. यह एक अत्यंत महत्वपूर्ण methodological मुद्दा है. समाई और एक रिकॉर्डिंग विंदुक के प्रतिरोध दर्ज संकेत फ़िल्टर कर सकते हैं. यह बहुत संभावना है कि छोटे कार्रवाई धाराओं विंदुक है, जो ठीक से अधिकांश एम्पलीफायरों, headstage के उच्च प्रतिरोध के कारण के साथ मुआवजा नहीं किया जा सकता है की समाई चार्ज में खो रहे हैं. जब इन संकेतों को नहीं चल पाता जाना, न्यूरॉन के स्पष्ट फायरिंग पैटर्न सच फायरिंग पैटर्न को प्रतिबिंबित नहीं करता. इसी तरह, uncompensated विंदुक और सील resistances जब कार्रवाई धाराओं को व्यक्त कर रहे हैं जैसे परिवर्तन (13) के दौरान मापन में महत्वपूर्ण त्रुटियों के कारण. कुछ एम्पलीफायरों समाई और प्रतिरोध विंदुक और सील, जो संकेत हानि की सीमा के लिए "मुआवजा" प्रदान करते हैं, लेकिन सबसे एम्पलीफायरों उच्च प्रतिरोध सिर चरणों इष्टतम मुआवजा बाधा. दूसरे, एक कृत्रिम स्थिति सेल पर लगाया है. वोल्टेज दबाना मोड में, कोशिका झिल्ली के आसपास के क्षेत्र में एक निश्चित क्षमता के लिए आयोजित किया जाता है, इन अध्ययनों, 0 एम वी में. इसका मतलब यह नहीं है वहाँ नहीं चालू है कोशिका झिल्ली को लागू. वोल्टेज दबाना में मापा संकेत वास्तव में झिल्ली के लिए तय की क्षमता बनाए रखने के लिए लागू वर्तमान की राशि है. इसलिए, यह लागू मौजूदा सेल गतिविधि में परिवर्तन कर सकते हैं.
GnRH प्रणाली में दोहरी रिकॉर्डिंग विशेष रूप से GnRH न्यूरॉन्स और उनके फैलाना वितरण की सीमित संख्या के कारण चुनौती दे रहे हैं. दोहरी रिकॉर्डिंग के सफल होने के लिए जोड़तोड़ बेहद स्थिर होना चाहिए. यहां तक कि इलेक्ट्रोड के मामूली आंदोलन विंदुक का कारण के लिए रवाना न्यूरॉन पर्ची और रिकॉर्डिंग के अंत कर सकते हैं. इसके अलावा, सेल पर विंदुक के आंदोलन (उदाहरण के लिए, फिर से स्थिति को आंदोलन के लिए क्षतिपूर्ति) फायरिंग पैटर्न बदल सकते हैं. कुछ आयन चैनलों जैसे N-प्रकार कैल्शियम चैनल यंत्रवत् संवेदनशील हैं: झिल्ली खिंचाव दोनों पूरे सेल और सेल संलग्न रिकॉर्डिंग विन्यास (14) में दोहरावदार गतिविधि का कारण बनता है. अंत में, जोड़तोड़ प्रणाली निहायत ठीक है और चिकनी गति के लिए सक्षम होना चाहिए. जैसा कि ऊपर दोहरी रिकॉर्डिंग के साथ, ने कहा, एक दो पहले से चयनित न्यूरॉन्स की सतह के लिए एक ही समय और सील करने का प्रयास दो pipettes लेताएक न्यूरॉन. यदि सफल, फिर एक प्रयास दूसरा सेल मुहर. आम तौर पर, एक सील और हर प्रयास के साथ एक उच्च गुणवत्ता रिकॉर्डिंग नहीं की उम्मीद कर सकते हैं. यह, हालांकि, दोहरी रिकॉर्डिंग के साथ एक विशेष समस्या पैदा करता है. यदि एक पहली न्यूरॉन के साथ सफल है, लेकिन दूसरे के साथ विफल रहता है, एक विंदुक को बदलने और एक अलग सेल की कोशिश करना चाहिए. इसलिए, एक सफलतापूर्वक सील न्यूरॉन में बाधा पहुँचा के बिना अच्छी तरह छिड़काव के शीर्ष (विंदुक परिवर्तन) के लिए दोनों माइक्रोस्कोप के विसर्जन के उद्देश्य और विंदुक को स्थानांतरित करने के लिए सक्षम होना चाहिए.
हमारे विकास और दोहरी रिकॉर्डिंग के लिए ढीला सेल संलग्न दृष्टिकोण के उपयोग GnRH न्यूरॉन्स अध्ययन में एक प्रमुख तकनीकी अग्रिम है. यह उपयोगी परिणाम है कि क्षेत्र आगे काँपने के गुणवाला हार्मोन स्राव में परिणाम है कि तंत्र क्या समन्वित गतिविधि आबाद महत्वपूर्ण प्रश्न के संदर्भ में ले जाने के मदद मिलेगी उत्पादन की संभावना है
मैं रोनाल्ड एल Calabrese, Dieter शुद्ध ऊनी कपड़ा (Emory विश्वविद्यालय) और वार्ड Yuhas (Axon उपकरण) उपयोगी तकनीकी चर्चा के लिए आभारी हूँ.