Summary
本视频演示了如何封装和文化癌细胞PuraMatrix，市售的自组装肽凝胶。
Abstract
越来越多的证据表明，在三个层面培养的癌细胞更准确地概括了肿瘤生物学的复杂性。许多这些模型利用来自动物生长因子和细胞因子可以影响这些细胞培养模型的生长，它含有一个可变数量的重组基底膜。在这里，我们详细描述了PuraMatrix，市售的自组装肽的凝胶，是缺乏动物源性材料和封装和卵巢癌OVCAR - 5细胞系，传播的病原体的编制和使用。我们首先介绍如何准备PuraMatrix，使用前。下一步，我们将演示如何正确PuraMatrix和细胞悬液混合封装在水凝胶的细胞。后的细胞培养基或注射到另外一种生理环境，PuraMatrix肽成分迅速自我组装成一个三维凝胶，展品5-200纳米的平均孔径在纳米尺度的纤维结构
Protocol
技术注释：
- 除了盐发起凝胶。因此，关键是没有盐PuraMatrix接触，直到凝胶需要;接触到非常低的离子强度的盐（例如，<0.05 M）将造成不可逆的凝胶。
- 剩余的股票，准备解决方案，可用于在稍后的日期，只要他们没有与盐接触。您不必担心重复超声。
- aliquoting PuraMatrix到无菌管离心可以去除气泡。
- 在媒体的变化非常小心，因为愿望可以很容易地破坏PuraMatrix床。
材料：
BD PuraMatrix RAD16肽凝胶，1％（CAT＃354250）：未稀释的混合物总肽浓度为10毫克/毫升。
- 水浴Sonicator或涡
- 96孔细胞培养皿
- 细胞培养基
- 无菌过滤H 2 O
- 无菌过滤20％的蔗糖
- 细胞（所有在5000细胞/孔）：OVCAR - 5
所有步骤必须在无菌条件下进行。
程序：
- 超声在一个30分钟的水浴sonicator的1％PuraMatrix（RAD16），以降低粘度，使用前。
- 1％PuraMatrix解决方案现在可以分装到无菌管，以简化以后的实验。
- 避免形成气泡，如果他们的形式简单地旋转了包含5分钟在1000转（300 XG）PuraMatrix无菌管。
- 未稀释的混合物的总肽浓度为10毫克/毫升。
- 两套4口井将在2.5 mg / ml和1.25 mg / ml的总肽浓度分别镀。
- 稀释的PuraMatrix，在0.2微米的无菌过滤20％的蔗糖和13.3％的蔗糖总肽浓度5毫克/毫升和2.5毫克/毫升，每一个2X的BD PuraMatrix浓度分别达到10％的蔗糖。
- 为了使20％的蔗糖，用稀蔗糖10克，体积50毫升的水。
- 可以准备稀释的20％的股票解决方案，13％和10％的蔗糖。
- 13％的蔗糖（每10毫升）：6.5毫升20％的蔗糖+ H 2 O 3.5 ml无菌
- 10％蔗糖（每10毫升）：5.0毫升20％的蔗糖+ 5.0 ml无菌H 2 O。
- 你打算板井数的基础上，准备一个PuraMatrix肽预混。 （参见下面的例子），然后个别管分装成含有25毫升的主结构。
- 主结构应准备两倍所需的最后总肽浓度，因为它会与细胞在电镀等体积稀释。
- 主结构应准备两倍所需的最后总肽浓度，因为它会与细胞在电镀等体积稀释。
- trypsinizing细胞单层细胞培养制备细胞悬液。
- 可用于每个T - 75合剂2毫升0.05％胰蛋白酶EDTA。
- 中除了含有10％热灭活胎牛血清（使用至少2毫升每毫升在上一步中使用的胰蛋白酶媒体。）细胞培养媒体的胰蛋白酶
- （〜300 XG）在1000 rpm离心5分钟，以创建一个细胞沉淀细胞。
- 重悬的细胞在10％的无菌过滤蔗糖。
- 计数细胞，并再次降速5分钟，在1000 rpm（〜300 XG）以去除微量的盐，在媒体上发现的金额。
- OVCAR - 5细胞重悬在10％的蔗糖在2.0 × 10 5细胞/ ml，使每口井，每口井的最后细胞计数将在5000细胞。
下面的步骤应该迅速执行。 - 加入25μl2.0 × 10 5细胞/ ml的混悬液的第一个人管，在上面的原理图所示PuraMatrix主组合含有25μL。
- 快速混合管移液器（〜5倍上下），而不会引入气泡。
- 然后移液器50μL细胞悬液/ PuraMatrix混合到适当以及一个96孔盘。
- 发起凝胶轻轻吹打一侧以及150μL细胞培养基（RPMI + 10％FBS）的BD PuraMatrix
- 重复8所述的步骤，直到所有的水井都被镀。
- 30分钟后， 轻轻取出1〜2 / 3的媒体使用200μL移液器平衡水凝胶的pH值。
- 不要使用真空吸引器，因为这会破坏矩阵
- 放置在井使枪头它不触及PuraMatrix床，轻轻地清除以及媒体。
- 应注意不破坏PuraMatrix文化在细胞中的矩阵。
- 轻轻加150μL新鲜细胞培养基PuraMatrix封装以及含有细胞的一侧。
- 通过仔细重复步骤10和11，更改每口井，每48小时的新鲜培养基中的细胞培养基。
代表性的成果：
图1。OVCAR - 5细胞被封装在上述协议中所述。被收购的图片使用奥林巴斯FV1000一个倒置显微镜配备了光谱物理DeepSee钛蓝宝石激光调谐到750纳米。天1次，3，5和7电镀后进行影像会议。长工作距离，水浸渍40倍的目标（奥林巴斯LUMPLFLN 0.8 NA）是用于图像通过PuraMatrix。立体卷收集通过收购在1.47微米轴向步骤的图像堆栈。两个非退扫描探测器收集到的自体荧光的排放，使用紫外线（440-490纳米）和绿色（510-550纳米）的带通滤波器。最终图像和深度的堆栈电影使用ImageJ处理相结合，两个检测通道。请点击这里看到图1的放大版本。
References
- Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures. PLoS One. 1, e119-e119 (2006).
