KLRG1 四聚体的制备方案

摘要

本方案描述了KLRG1四聚体的制备方法，这是一种用于分析KLRG1配体的有力工具。

摘要

杀伤细胞凝集素样受体G1（KLRG1）是一种属于C型凝集素样超家族的II型跨膜糖蛋白抑制性受体。KLRG1以单体和二硫键连接的同源二聚体两种形式存在。这种高度保守的受体表达于最成熟且近期被激活的自然杀伤细胞上，同时也表达于一部分效应/记忆T细胞亚群中。

利用KLRG1四聚体及其他方法，已鉴定E-、N-和R-钙黏蛋白为KLRG1的配体。这些依赖Ca²⁺的细胞间黏附分子包含一个胞外结构域，该结构域含有五个介导细胞间相互作用的钙黏蛋白重复序列，以及一个跨膜结构域和一个与肌动蛋白细胞骨架相连的胞质结构域。

KLRG1四聚体的制备对于鉴定KLRG1配体至关重要。KLRG1四聚体也是一种独特的工具，可用于阐明钙黏蛋白与KLRG1在调控免疫应答及组织完整性中所发挥的作用。

方案

包涵体的制备

1. 将表达KLRG1质粒构建体的细菌过夜培养物接种至4个500 ml的TB培养基中，每个培养基含有50 μg/ml羧苄青霉素和氯霉素。当600 nm处的OD值达到0.6 Å时，加入0.4 M IPTG进行诱导，并在37°C下继续振荡培养4小时。
2. 用重悬缓冲液（pH=8.0，含50 mM Tris-HCl、25% (W/V) 蔗糖、1 mM EDTA、10 mM DTT）重悬收集的菌体。注意：此步骤的菌体沉淀可在此阶段冷冻保存。
3. 将不超过60 ml的菌体重悬液汇集至一个聚丙烯烧杯中。如有必要，用pH 8.0的TE缓冲液调整体积至60 ml，并以半速搅拌混合物。
4. 在搅拌过程中逐滴加入以下成分：溶菌酶（终浓度=1 mg/ml）、MgCl₂（终浓度=5 mM）、含75 mM NaCl的50%甘油中的2 mg DNA酶I、Triton-X100（终浓度=1%）、DTT（终浓度=10 mM）。
5. 将溶液在冰上超声处理1.5分钟，然后在4°C下以5,000 RPM离心10分钟。
   1. 倾去上清液。
   2. 加入15 ml洗涤缓冲液（pH=8.0，含50 mM Tris-HCl、0.5% Triton X-100、100 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT）。
   3. 在冰上将溶液超声处理1.5分钟，直至沉淀完全重悬。....

讨论

本方案展示了如何纯化、生物素标记并四聚化KLRG1。KLRG1四聚体可用于通过流式细胞术标记KLRG1配体。尽管每种蛋白质的复性条件需通过实验经验确定，但其他C型凝集素可采用类似方案进行四聚化。利用四聚化的蛋白质作为探针，有望鉴定孤儿C型凝集素受体的配体。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BirA 酶和缓冲液	生物素化试剂盒	Avidity	BIRA500
Complete Mini 蛋白酶抑制剂片剂，无 EDTA	试剂	Roche 集团	11 836 170 001	或同等产品
Amicon 搅拌式超滤池	设备	EMD Millipore	型号 #8400	或同等产品
YM10 NMWL 10K 超滤膜	过滤耗材	EMD Millipore	13642
15 ml YM10 浓缩管	过滤耗材	EMD Millipore	4411
AKTAFPLC	设备	GE Healthcare	18-1900-26
Sephacryl S-200 16/60 高分辨率柱	设备	GE Healthcare	17-1166-01
链霉亲和素 PE	试剂	BD Biosciences	554061	或同等产品