Histologia óssea Undecalcified fornece informações importantes para uma variedade de aplicações clínicas e de pesquisa. É tecnicamente desafiador, especialmente com amostras de grande porte. Este vídeo ilustra o processo de produção de seções de boa qualidade e demonstra as dificuldades técnicas e métodos com os quais a superá-los.
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Artigo de método
Preparação óssea Undecalcified de Histologia, Histomorfometria e Análise Fluorocromo
Neste artigo
Resumo
Resumo
Histologia óssea Undecalcified demonstra a micro-arquitetura do osso. Ele mostra tanto os componentes mineralizados e celulares do osso, que fornece informações vitais sobre o turnover ósseo ou formação e reabsorção óssea. Isto tem uma enorme importância em uma variedade de aplicações clínicas e de pesquisa. Ele produz belas imagens 1 e permite técnicas como a avaliação fluorocromo e histomorfometria 2. Análise fluorocromo é uma técnica onde corantes fluorescentes que se ligam ao cálcio são injetados em um ponto determinado momento, que permite a quantificação da quantidade de mineralização naquele momento. Histomorfometria é um processo de quantificação do osso ao nível microscópico.
Realizar histologia óssea undecalcified é tecnicamente desafiador, especialmente com amostras de grande porte. Ela exige variações na técnica dos utilizados em parafina padrão incorporado histologia. Este vídeo ilustra o processo de produção de seções de boa qualidade e demonstra as dificuldades técnicas e métodos com os quais a superá-los. Preparação de amostras de fixação e processamento são alcançados com uma forma semelhante a outros tecidos moles, no entanto, devido à densidade e menor permeabilidade do osso consideravelmente maior fixação e os tempos de processamento são necessárias, muitas vezes levando várias semanas. Incorporação é alcançado usando um meio de suporte com dureza semelhantes ou iguais e densidade do osso, como metacrilato de resinas à base, mas ao contrário de infiltração de parafina e incorporação, este é um passo irreversível. Seccionamento pode ser conseguido através de moagem, que produz uma espessa seção, que é ótimo para os estudos, como a análise fluorocromo. Este é o melhor conseguido usando uma lâmina de diamante em uma macrotome. Alternativamente, as seções mais finas podem ser produzidas por microscopia de luz e isso é conseguido usando um micrótomo trenó com uma lâmina muito afiada. O micrótomo sledge fornece a maior resistência e estabilidade necessária para grandes blocos rígidos. Seções de resina incorporado pode ser manchado com uma variedade de manchas, que são demonstradas.
Protocolo
- O tecido é colocado em um recipiente selado contendo fosfato tamponado a 10% solução de formalina 3. Garantir que a exposição mínima à luz, se a análise fluorocromo é para ser realizado, como a fluorocromos são sensíveis à luz.
- Estabelecer qual a orientação do tecido serão necessários.
- Apare a amostra com o tamanho, na orientação correta, usando uma serra de fita. Medidas de garantir a segurança são cumpridas. A amostra é então colocada em um recipiente opaco, cujo volume deve ser de aproximadamente dez vezes o tamanho da amostra para obter uma fixação adequada. O espécime deve permanecer na solução de formalina um total de entre uma e duas semanas dep....
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Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer o apoio da Sra. Sue Connell por sua especialização na incorporação de resina e Túmulos Ms Stephania para sua perícia em laboratório. Os autores gostariam de agradecer ao professor Frank Kandziora e Dr. Marie-Anne Polboth para os seus conselhos.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
Solventes:
(Reagentes de GRALE Científica)
- 10% normal Buffered ácido formalina, Xileno Etanol e Butanol
Todos grau histológico, livre de enxofre.
GRALE Scientific Pty Ltd.
http://www.grale.com.au
- Descascar, moldes de plástico
GRALE Scientific
- Microscópio SuperFrost slides PLUS
Lomb Scientific Pty Ltd.
http://www.lomb.com.au
- Technovit GlycolMethacrylate 7100
Heraeus Kulzer
http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm - Fazendo bloco de resina-Technovit 3040 bloco Histo
Heraeus Kulzer
(Reagentes de GRALE Científica)
Trichrome Goldner da mancha
1. Ferro Weigert hemotoxylin (DeGroat)
| a) solução Hemotoxylin | |
| Hemotoxylin | 1g |
| Álcool absoluto | 100mL |
| b) Solução de Ferro | |
| 30% de cloreto férrico aquosa | 4mL |
| Ácido clorídrico (concentrado) | 1mL |
| água destilada | 95mL |
Filtrado e adicionado volume igual de hemotoxylin imediatamente antes mancha usado.
2. Ponceau-fucsina-azophloxin soluções estoque
| a) solução de Ponceau xilidina | |
| Ponceau de xilidina | 0,75 g |
| fuchsion ácido | 0.25g |
| Ácido acético | 1mL |
| mix, e adicionar água destilada (100ml) | |
| b) solução azophloxin | |
| Azophloxin | 0.5g |
| Ácido acético | 0,6 ml |
| mix, e adicionar água destilada (100ml) | |
| c) Final solução de trabalho mancha | |
| Ponceau-fucsina solução | 5-10ml |
| Azophloxin | 2mL |
| Solução de ácido acético 0,2% | 88mL |
3. Solução Green Light
| Luz verde | 1g |
| ácido acético | 1mL |
| Misture e adicione água destilada (500ml) | |
4. Phophomolybdic ácido-Orange solução G
| Ácido fosfomolíbdico | 3g |
| Laranja G | 2g |
| Dissolver em 500mL de água destilada e adicionar timol cristal. | |
Von Kossa Stain
| 1% de nitrato de prata aquoso |
| Tiossulfato de sódio 2,5% |
| 1% de safranina O |
Alcian mancha azul
| Alcian blue 8GX | 1g |
| Solução de ácido acético 3% | 100mL |
Hemotoxylin e eosina
| a) hemotoxylin Harris | |
| Hemotoxylin | 2.5g |
| Álcool absoluto | 25mL |
| Alum de potássio | 50g |
| água destilada | 500mL |
| óxido de mercúrio | 1,25 g OR |
| Iodato de sódio | 0.5g |
| Ácido acético glacial | 20mL |
| b) solução de Eosina | |
| Eosina produzido comercialmente foi usado. | |
Todos os pós corante mancha são pós Gurr corante.
Todos os reagentes são reagentes analíticos, e não Lab reagentes
Fluorocromos
Fabricante | Fluorocromo | Número Catálogo |
| Sigma-Aldrich, Sydney | Calceína Verde | C0875 |
| Sigma-Aldrich, Sydney | Alizarina complexona | A3882 |
| Intervet Austrália, Victoria | Oxitetraciclina (Fora da droga antimicrobiana prateleira) | Comercial; Engemycin 100 |
Referências
- Kerr, J. Atlas of Functional Histology. , Harcourt Publishing. Melbourne, Australia. 164-168 (2000).
- Parfitt, A. M. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner R....
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Reimpressões e permissões
