剖析器官的成年斑马鱼

Summary

本协议描述了识别和解剖成年斑马鱼的器官的过程。

Abstract

在过去的20年中，斑马鱼已成为一个强大的模式生物，为了解脊椎动物的发育和疾病。虽然是广泛的胚胎和幼虫的实验分析和形态一直都有详细记载，成年斑马鱼的解剖和发展成人的结构和器官的研究说明，连同与成人工作的技术，所缺乏的。幼虫机关接受在其整体结构，形态，解剖位置，并在向成年过渡的幼虫的重大变化。从外部看，透明的幼虫发展其特点成人条纹色素模式和配对腹鳍，而在内部，机关经过大量增长和重塑。此外，bipotential性腺原基发展成为无论是睾丸或卵巢。该协议确定成人的许多器官和演示脑，性腺，肠胃系统，心脏，和成年斑马鱼的肾脏解剖的方法。可用于原位杂交，分子生物学技术，组织学，免疫组织化学法提取RNA，蛋白质分析，和其他解剖器官。该协议将有助于在斑马鱼在扩大研究范围，包括幼虫器官的重塑，成人器官系统的成年和其他调查机关的具体形态发生。

Protocol

将一只雄性斑马鱼解剖第一，其次是雌鱼。开始剥离之前，麻醉在0.2％Tricaine的鱼，然后安乐死在冰水中的潜伏期为15分钟。 首先，轻轻拍着干纸巾上的鱼放在解剖垫。对外，斑马鱼有单一的背鳍，尾鳍和臀鳍和成对的胸鳍和腹鳍（图1）。 图1。成人男性标有鳍鱼类。 引脚通过解剖垫鱼尾巴的肉质部分和眼圈腹侧部分。 剪断腹鱼的臀鳍前的皮肤。剪切沿着腹部的皮肤和下面的肌肉从臀鳍到鳃盖（硬覆盖在鳃）（图2，第1步）。 图2，在去除皮肤和体壁肌肉暴露内部器官的步骤。 接下来，删除的鳃盖和胸鳍，包括肩带（厚，鳍基骨的区域）（图2，第2步）。切沿一侧的鱼，从现在暴露的鳃后部皮肤及以上潜在的肌肉开始又回落到臀鳍（图2，第3步）。 小心取出从一侧的鱼的皮肤和下面的肌肉。现在许多内部器官可见（图3）。 图3。成年雄鱼体壁肌肉除去，使机关内部的可视化。 睾丸长，白色，配对，连接到背体壁机关。取出睾丸和地方菜的PBS。反射光检查睾丸曲细精管（图4），其中包含各个阶段发展spermatagonia到精子的生殖细胞囊肿（莱亚尔等，2009）可视化。 图4。睾丸解剖。白色圆形的结构，曲细精管。 下一步，清除肠胃系统从鱼的体腔。规模大，叶状形态，tannish颜色，和广泛的血管，肝脏，可确定。胆囊，一个绿色的半透明的充满液体的囊，脾，出现鲜红色，内脏内被发现。 从其他机关单独小肠和伸展出来。高度上皮褶皱（Wallace等人，2005年）的前，中，后肠道内的地区被定义。 将一块在PBS肠道和使用透射光观察上皮褶皱。 接下来，检查的鱼鳔。鳔后房型通过气动管，和前房通过韦伯器具（芬尼等人，2006年），它是连接到内耳，它是连接到食道。 删除和丢弃的鱼鳔。不固定的鱼，并重新针它的腹侧方解剖肾，这是位于沿背侧体壁。肾脏是一种半透明的粉红色的结构与背主动脉和色素细胞相关。肾脏分为头部，身体和尾部区域（图5）。解剖出一块肾脏和地方的PBS。梳理除了肾组织透露肾小管。 图5。头部，身体和尾部沿肾脏背侧体壁的位置。 解剖雌鱼。如前所述，安乐死在冰水中的鱼和寄托解剖垫之前，帕特干燥。正如先前所表现出的鱼从一侧取出皮肤。卵巢是一个bilobed结构，悬浮体腔血管卵巢系膜。 取出卵巢叶，在PBS的地方，并与透射光检查。卵母细胞可以被戏弄除了使用细针，然后上演（图6中，塞尔曼等，1993年）。舞台上我的卵母细胞大约有10 – 150微米的大小和半透明。第二阶段的卵母细胞约150 – 350微米大小和皮质颗粒的外观定义。第三阶段卵母细胞有350 – 750微米大小，由于卵黄的积累，是不透明的。成熟阶段IV和V的卵母细胞是半透明的，一般不会在最近交配的女性卵巢中发现。 图6现场舞台下观察我，二，三卵母细胞。解剖显微镜透射光。 接下来，解剖鱼的心脏。心脏位于鳃后，腹。首先切出心脏和周围组织，并把它在PBS。仔细剖析了心脏周围的组织，小心不要损伤娇嫩的心房。 将解剖林格氏液，观察心脏跳动的心脏。 确定的心房，心室和bulbus动脉（图7，胡锦涛等，2001）。 图7。解剖成人心脏。 完成去除鱼的大脑解剖。 unpinning鱼，用刀片去除头部开始。尽可能从取出的头骨与腹侧方钳尽可能多的软组织。取出的眼睛，用小弹簧剪刀。破开的头骨和消除大脑的腹侧骨。现在放置在头菜的PBS和消除大脑背侧皮肤和头骨。 确定的嗅球，端脑，缰，视神经顶盖，小脑和延髓（图8，Wullimann等，1996;席林，2002）。 图8。成年斑马鱼的大脑解剖。背视图，前顶。

Materials

Reagents:

0.2% Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)
200 mg tricaine powder
97.9 ml DD water
~1 ml 1 M Tris (pH 9)
Adjust pH to 7.0

Phosphate buffered saline (PBS)
4.0 g NaCl
0.1 g KCl
100 ml 0.1 M PO₄ Buffer, pH 7.3
150 ml dH₂O

Ringer’s solution
6.7g NaCl
0.2g KCl
0.2g CaCl₂
1.2g Hepes
1 L H₂O
Adjust pH to 7.2

Equipment:

Dissecting dish with mat
Electron Microscopy Sciences
catalog #70540

Vannas spring scissors
Fine Science Tools
catalog #91500-09