Studera Synaptic Blås Pools hjälp Photoconversion av Styryl Färgämnen
Summary
FM-färgämnen har varit till ovärderlig hjälp i förståelsen av synaptiska dynamik. FMS är normalt följs under fluorescerande mikroskopet under olika stimulering förhållanden. Dock medger photoconversion av FM färgämnen i kombination med elektronmikroskopi visualisering av olika synaptiska vesikler pooler, bland annat ultrastruktur komponenter, synaptiska boutons.
Abstract
Sammansmältningen av synaptiska vesiklar med plasmamembranet (exocytos) är ett obligatoriskt steg i signalsubstansen release och neuronal kommunikation. Den blåsor därefter hämtas från plasmamembranet (endocytos) och grupperas tillsammans med den allmänna pool av blåsor i nervändsluten, tills de genomgå en ny exo-och endocytos cykel (vesikler återvinning). Dessa processer har studerats med hjälp av olika tekniker såsom elektronmikroskopi, elektrofysiologi inspelningar amperometry och mätningar kapacitans. Viktigt under de senaste två decennierna ett antal fluorescerande markörer fram, vilket gör att optiska metoder för att spåra blåsor i deras återvinning dynamik. En av de mest använda markörerna är styryl eller FM-färg 1, strukturellt, alla FM färgämnen innehåller en hydrofil huvud och en lipofil svans ansluten via en aromatisk ring och en eller flera dubbelbindningar (Figur 1B). En klassisk FM färgämne experiment att märka en pool av blåsor består i att bada beredningen (bild 1Ai) med färgen under stimulering av nerv (elektriskt eller med höga K +). Detta leder vesikler återvinning och den efterföljande lastning av färgämnet i nyligen endocyteras blåsor (bild 1A I-III). Efter lastning av blåsor med färg, en andra omgång av stimulering i ett färgämne utan badet skulle utlösa FM genom exocytos (bild 1A IV-V), process som kan följas av att övervaka fluorescensintensitet minskning (avfärgning).
Även FM-färgämnen har bidragit starkt till området för vesikler återvinning, är det inte möjligt att avgöra det exakta lokalisering eller morfologi av enskilda blåsor med hjälp av konventionella fluorescensmikroskopi. Därför förklarar vi här hur FM-färgämnen kan också användas som endocytic markörer med hjälp av elektronmikroskopi, genom photoconversion. Den photoconversion Tekniken utnyttjar ägs av fluorescerande färger för att generera reaktiva syreradikaler under intensiv belysning. Fluorescerande preparat är nedsänkt i en lösning innehållande Diaminobenzidin (DAB) och belysta. Reaktiva ämnen som genereras av färg molekyler oxiderar DAB, som utgör en stabil, olöslig fällning som har ett mörkt utseende och kan lätt urskiljas i elektronmikroskopi 2,3. Eftersom DAB är bara oxideras i omedelbar närhet av fluorescerande molekyler (som den reaktiva syreradikaler är kortlivade), ser den teknik som bara fluorescerande strukturer kommer att innehålla elektron-täta fällning. Tekniken gör alltså att studera den exakta platsen och morfologi aktivt återvinning organeller.
Protocol
Discussion
Några viktiga åtgärder som bör beaktas:
- DAB inkubation ska endast ske efter noggrann tvätt och härdning av förberedelserna. Annars icke-reagerade glutaraldehyd kommer att interagera med DAB och orsaka dess nederbörd (vanligtvis i form av platta kristaller, som inte är elektron tätt). Förberedelserna där denna utfällning sker i överflöd är sällan användbara för elektronmikroskop.
- Belysning gånger bör optimeras, genom att testa flera identiska preparat med olika belysning tider….
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FM 1-43 | Invitrogen | F10317 | ||
| Epon resin | Plano | R1030 | ||
| di-aminobenzidine hydrochloride | Sigma | D5905 | ||
| 50% Glutaraldehyde | AppliChem | A3166 | EM grade | |
| Sylgard | Dow Corning | 104186298 | ||
| Axioskop 2 FS plus | Zeiss | |||
| Objective 20x 0.5 NA | Olympus | Dry objective | ||
| 100W Hg Lamp | Zeiss | |||
| Lamp housing with back mirror | Zeiss | 1007-980 | ||
| MRm camera | Zeiss | 0445-554 | Image acquisition | |
| Ex. Filter (HQ 470/40) | AHF | F49-671 | ||
| Dichroic (495 DCLP) | AHF | F33-100 | ||
| Em. Filter (HQ 500 LP) | AHF | F42-018 | ||
| EM | Zeiss | |||
| Proscan CCD HSS | Proscan Electronic Sys. | 1024 x 1024 |
References
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
- Henkel, A. W., Lübke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).
- Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).
- Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).
- Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles. Science. 303, 2037-2039 (2004).
- Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons. Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).
- Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).
- Lange, R. P. J. d. e., de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held. J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).
- Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction. Neuron. 39, 529-541 (2003).
