تقييم المحاكمات تبلور ثنائي الأبعاد للبروتينات غشاء الصغيرة للدراسات البيولوجيا الهيكلية التي البلوريات الكترون
Summary
تقييم ثنائي الأبعاد المحاكمات التبلور (2D) لتشكيل المصفوفات أمرت بروتين الغشاء هو مهمة حرجة وصعبة للغاية في البلورات الإلكترون. نحن هنا وصف نهجنا في الكشف عن وتحديد 2D بلورات صغيرة من بروتينات غشاء الغالب في نطاق 15 — 90kDa.
Abstract
وقد تطورت الإلكترون البلورات كوسيلة التي يمكن استخدامها كبديل أو بالاشتراك مع ثلاثي الأبعاد وبلورة البلورات بالأشعة السينية لدراسة بنية وظيفة أسئلة للبروتينات الغشاء ، فضلا عن البروتينات القابلة للذوبان. الكشف عن بلورات (2D) ثنائي الأبعاد بواسطة المجهر الإلكتروني انتقال (EM) هي خطوة حاسمة في إيجاد ، والأمثل ، واختيار العينات لجمع بيانات عالية الدقة عن طريق البرد EM. نحن هنا وصف الخطوات الأساسية في تحديد كل كبيرة وأمر ، وكذلك المصفوفات 2D الصغيرة ، التي يمكن أن العرض المعلومات قد تكون حاسمة لتحسين ظروف التبلور.
من خلال العمل مع تكبير مختلفة في طب الطوارئ ، يتم الحصول على بيانات عن مجموعة من المعلمات حرجة. انخفاض امدادات التكبير بيانات قيمة عن حجم التشكل والأغشية. في أعلى تكبيرا ، ويتم تحديد أبعاد ممكن الكريستال النظام و2D. في هذا السياق ، هو وصفها كيف تستخدم الكاميرات لاتفاقية مكافحة التصحر على الإنترنت ، ويتحول فورييه في أعلى تكبيرا لتقييم proteoliposomes عن النظام والحجم.
بينما هي الأكثر شيوعا نمت بلورات 2D للبروتينات غشاء التي كتبها إعادة غسيل الكلى ، وتقنية فحص ينطبق أيضا على بلورات أنتجت بمساعدة monolayers ، 2D الكريستال الأصلي ، وأمرت صفائف من البروتينات القابلة للذوبان. قد بالإضافة إلى ذلك ، الأساليب المذكورة هنا تنطبق على الكشف عن بلورات 2D من أصغر وكذلك بروتينات غشاء أكبر ، حيث أصغر البروتينات تتطلب نفس القدر من العناية في تحديد كأمثلة لدينا وشعرية وأكبر من البروتينات يمكن التعرف بسهولة أكبر في المراحل الأولى من الفرز.
Protocol
Discussion
التقييم السليم للعينات يتطلب تقييم دقيق لعدد كاف من الأغشية. على سبيل المثال ، أعطى العينات مع منخفضة تصل إلى 2 ٪ صفائف البلورية من أصل أكثر من 180 proteoliposomes تصوير المعلومات الهامة عن التحسين السريع لظروف تبلور 2D 7.
عندما ترسب ا?…
Acknowledgements
نشكر المتعاونين لدينا لتقديم عينات من البروتين قيمة ، والتي ساهمت في بعض طرقنا من الخبرة ذات الصلة ، والملاحظات. غونتر Schmalzing قدمت تفضلت الفرصة لFR للانضمام إلى هذا المشروع. وشكرت باربرا أرمبروستر ، برينك يعقوب وديريك ميلز لمساعدتهم المعلقة ومدخلات بشأن المعدات. وقدم التمويل من المعاهد الوطنية للصحة منح HL090630.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 400-mesh copper TEM grids coated with carbon film | ||||
| forceps: regular and anti-capillary | Dumont #5 and Dumont N5AC or similar | |||
| Micropipette and pipette tips | ||||
| Whatman #4 filter paper | ||||
| 1% uranyl acetate | ||||
| Dialysis sample to be screened for 2D crystals | ||||
| Glycerol/sucrose-free dialysis buffer | Optional | |||
| JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM) | similar 80 – 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) |
References
- Johansen, B. V. Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage. Micron. 7, 145-156 (1976).
- Schmidt-Krey, I. Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy. Methods. 41, 417-426 (2007).
- Wang, D. N., Kühlbrandt, W. High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media. J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).
- Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles. Micron. , (2010).
- Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., Kühlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent γ-glutamyl carboxylase. J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).
- Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 Å resolution. J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).
- Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters. J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).
- Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. Towards automated screening of two-dimensional crystals. J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).
- Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).
