大鼠间充质干细胞（MSCs）的分离与富集及单克隆来源MSCs的分离

摘要

从大鼠股骨和胫骨中分离出MSCs，并通过磁性细胞分选进行富集。通过流式细胞术确认分选细胞表面标志物的表达。这些细胞还在克隆密度下培养以形成单个克隆，然后使用克隆环分离这些克隆。

摘要

间充质干细胞（MSCs）是一类成体干细胞，具有广阔的治疗应用前景。这些细胞可从骨髓中分离获得，并因其具有贴壁生长特性，可轻松与造血干细胞（HSCs）分离。本实验方案描述了如何从大鼠股骨和胫骨中分离MSCs。分离后的细胞进一步通过磁性细胞分选法，利用两种MSC表面标志物CD54和CD90进行富集。随后通过流式细胞术分析验证CD54和CD90表面标志物的表达。同时检测造血干细胞标志物CD45，以确认分选后的MSCs中是否已去除HSCs。MSCs在自然状态下具有较高的异质性，其中存在多种亚群，这些亚群在形态、增殖能力及分化潜能方面各不相同。这些亚群均表达已知的MSC标志物，但目前尚未发现可用于区分不同亚群的特异性标志物。因此，分离不同亚群的替代方法是使用克隆环分离单克隆来源的细胞。来源于单个克隆的细胞可分别进行培养和评估。

方案

1. 大鼠MSCs的分离

间充质干细胞取自6至8周龄的Sprague-Dawley雌性大鼠，分离方法如前所述^{1, 2}。分离得到的MSCs可贴附于塑料表面，并在体外培养中易于扩增。

1. 将动物放入麻醉室中，麻醉约五分钟。在麻醉过程中，观察其眨眼频率、呼吸频率和运动活动。一旦动物停止运动活动且眨眼频率变得稀少，立即将其从麻醉室中取出。
2. 将动物仰卧于手术台上，通过颈椎脱位法处死。剪下后肢的股骨和胫骨，去除皮肤和肌肉。
3. 将分离出的股骨和胫骨浸入70%异丙醇中数秒，随后转移至1× D-PBS中。
4. 在生物安全柜中，将股骨和胫骨转移至含有DMEM的10 cm培养皿中。用镊子夹住每根骨骼，用剪刀剪开两端。在3 ml注射器上安装22G针头，并吸入DMEM，将针头插入骨骼的一端开口，冲洗骨髓至50 ml离心管中。每根骨骼重复冲洗2~3次。待所有骨髓收集完毕后，重悬细胞，并将细胞悬液通过70 μm细胞筛网，以去除骨碎片和血细胞聚集体。
5. 在200 ×g、4°C条件下离心5分钟，吸弃上清液。将细胞重悬于25 ml MSC培养基（含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM）中。将10 ml细胞悬液接种至每个10 cm培养皿中，共接种两个培养皿。将培养皿置于37°C、5% CO₂的培养箱中培养1~2周，每2~3天更换一次培养基。

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讨论

本方案描述了如何分离和富集间充质干细胞（MSCs），并包含一种分离单克隆来源细胞的方法。成功的分离、富集及克隆分离涉及多个关键步骤。从大鼠中进行细胞分离时，建议通过细胞筛网或类似孔径的无菌尼龙膜过滤，以去除血凝块和骨碎片。细胞接种过夜后，培养基中会漂浮大量死亡细胞，此时更换新鲜培养基可去除死细胞，从而促进贴壁细胞的生长。

本方案中的磁性细胞分选技术描述了如何进行阳性筛选，类似的操作流程也可用于进行阴性筛选。抗体的添加量可能有所不同，需进行优化以获得更佳的分选效果。细胞标记用于流式细胞术分析时同样需要优化。若标记后的样本不能立即进行流式细胞术分析，可用2%甲醛固定后延迟检测。然而，不建议长期保存样本，因为这往往会导致自发荧光增强，从而降低样本质量。

菌落分离的关键在于以合适的细胞密度进行接种（需通过实验优化确定）以及挑选周围无其他克隆的单个克隆。如果附近存在其他克隆，克隆环可能会覆盖邻近的克隆，导致所获得的细胞不再来源于单一克隆。将克隆环放置于克隆上方时，注意不要在培养皿表面滑动，否则克隆环底部的硅脂会覆盖细胞，阻碍胰蛋白酶.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1X D-PBS	Invitrogen	14040-133
DMEM	Invitrogen	11885-084
细胞筛	BD Biosciences	352350
FBS	Invitrogen	26140-079
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140
胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25200-056
BD Imagnet	BD Biosciences	552311
生物素标记小鼠IgG2a	BD Biosciences	555572
生物素标记小鼠IgG1	BD Biosciences	555747
生物素标记抗大鼠CD54抗体	Cedarlane Labs	CL054B
生物素标记抗大鼠CD90抗体	Cedarlane Labs	CL005B
生物素标记抗大鼠CD45抗体	Cedarlane Labs	CL001B
BD Imag缓冲液	BD Biosciences	552362
圆底管	BD Biosciences	352063
链霉亲和素磁珠	BD Biosciences	557812
SA-PE	R&D Systems	F0040
克隆环	Sigma-Aldrich	C2059