Aislamiento y enriquecimiento de las células de rata madre mesenquimales (MSC) y la separación de una sola colonia Derivado MSC

Resumen

Rata MSC fueron aisladas de fémur y la tibia y luego enriquecido por la clasificación de células magnéticas. Células seleccionadas fueron confirmados para la expresión de marcadores de superficie por citometría de flujo. Estas células fueron cultivadas a una densidad de clones para formar colonias aisladas y luego estas colonias fueron separados por cilindros de clonación.

Resumen

MSC son una población de células madre adultas, que es una fuente prometedora para aplicaciones terapéuticas. Estas células pueden ser aisladas de la médula ósea y pueden separarse fácilmente de las células madre hematopoyéticas (HSC), debido a su adhesión de plástico. Este protocolo describe cómo aislar las MSC del fémur y la tibia de ratas. Las células aisladas se enriquecieron aún más en contra de dos marcadores de superficie CD54 y CD90 MSC por la clasificación de células magnéticas. Expresión de marcadores de superficie CD54 y CD90 fueron luego confirmadas por análisis de citometría de flujo. HSC marcador CD45 también se incluyó para comprobar si los ordenados MSC se agotaron las CMH. MSC son, naturalmente, muy heterogéneos. Hay subpoblaciones de células que tienen diferentes formas, la proliferación y diferenciación de las capacidades. Estas subpoblaciones todos expresan el conocido marcadores de CMM y ningún marcador único ha sido identificado por las distintas subpoblaciones. Por lo tanto, un enfoque alternativo para separar las distintas subpoblaciones está utilizando cilindros de clonación para separar de una sola colonia de células derivadas. Las células derivadas de las colonias solo se puede cultivar y evaluar por separado.

Protocolo

1. El aislamiento de MSC Rata

Las células madre mesenquimales fueron aisladas de 6-8 semanas de edad Sprague-Dawley hembra de rata como se describió anteriormente ^{1, 2.} MSC aisladas pueden adherirse a la superficie de plástico y fácilmente se expanden durante el cultivo in vitro.

1. El animal se puso en una cámara de anestesia y anestesiado durante unos cinco minutos. Durante la anestesia, observar el ritmo de la respiración intermitente, y la actividad motora. Quitar el animal de la cámara inmediatamente después de que se detenga la actividad motora y la tasa de parpadeo se convirtió en poco frecuentes.
2. Coloq....

Discusión

Este protocolo describe cómo aislar y enriquecer MSC. Un método para separar las células de una sola colonia de derivados también se ha incorporado. Hay varios pasos que son importantes para una separación exitosa de aislamiento, el enriquecimiento y la colonia. Mientras se hace el aislamiento de células de rata, se recomienda filtrar con un colador celular o una malla de nylon estéril de tamaño similar para deshacerse de los coágulos de sangre y restos óseos. Después de la siembra de las células durante la noche, mucha.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DPBS 1X	Invitrogen	14040-133
DMEM	Invitrogen	11885-084
Filtro celular	BD Biosciences	352350
SFB	Invitrogen	26140-079
Pen-Estrep	Invitrogen	15140
Tripsina-EDTA	Invitrogen	25200-056
Imagnet BD	BD Biosciences	552311
Biotina ratón IgG2a	BD Biosciences	555572
Biotina ratón IgG1	BD Biosciences	555747
Biotina anti-rata CD54	Cedarlane Labs	CL054B
Biotina anti-rata CD90	Cedarlane Labs	CL005B
Biotina anti-rata CD45	Cedarlane Labs	CL001B
Buffer BD Imag	BD Biosciences	552362
Tubo de fondo redondo	BD Biosciences	352063
Partículas de estreptavidina	BD Biosciences	557812
SA-PE	R&D Systems	F0040
Cilindro de clonación	Sigma-Aldrich	C2059