Identifiering av fenotyper tillväxthämning orsakad av Redovisning av Bakterie Typ III Effektenheter i jäst
Summary
I denna video beskriver vi ett förfarande för uttrycket av bakteriell typ III effektenheter i jäst och identifieringen av effektor-inducerad fenotyper tillväxthämning. Sådana fenotyper kan sedan utnyttjas för att belysa effektorfunktioner och mål.
Abstract
Många gramnegativa sjukdomsframkallande bakterier använder en typ III sekretion system till translocate en svit av effektor proteiner i cytosolen av värdceller. I cellen, typ III effectors undergräva värd cellulära processer för att undertrycka immunsvaret och främja patogen tillväxt. Många typ III effektenheter av vegetabiliska och animaliska bakterier har identifierats hittills, men bara ett fåtal av dem är väl karakteriserade. Förstå funktioner dessa effektenheter har underminerats av en kombination av funktionell redundans i effektor repertoar av en viss bakteriestam, de subtila effekter som de kan utöva för att öka virulens, roller som eventuellt specifika för vissa infektioner faser, och svårigheter att genetiskt manipulera vissa patogener. Redovisning av typ III effektenheter i spirande jäst<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Kan tillåta att kringgå dessa begränsningar och stöd till den funktionella karakterisering av effektor proteiner. Eftersom typ III effektenheter ofta mål cellulära processer som bevaras mellan jäst och andra eukaryoter, får sitt uttryck i jäst resultera i fenotyper tillväxt-hämning, vilket kan utnyttjas för att belysa effektorfunktioner och mål. Ytterligare fördelar med att använda jäst för funktionella studier av bakteriella effektenheter inkluderar deras genetiska lätthanterlig information om förutspådde funktioner allra flesta av deras ORFS, och tillgängligheten av många verktyg och resurser för både Genomomfattande och småskaliga experiment. Här diskuterar vi kritiska faktorer för att utforma en jäst för uttrycket av bakteriell typ III effektor proteiner. Dessa inkluderar en lämplig promotor för körning uttryck av effektor gen (er) av intresse, kopian nummer effektor gen använde epitop taggen för att verifiera proteinuttryck och jäst stam. Vi presenterar förfaranden för att inducera uttryck av effektenheter i jäst och att verifiera deras uttryck genom immunoblotting. Dessutom beskriver vi ett spotting analys på agarplattor för identifiering av effektor-inducerad fenotyper tillväxthämning. Användningen av detta protokoll får förlängas till studiet av sjukdomsframkallande faktorer som levereras in i värdcellen genom någon patogen och translokation mekanism.
Protocol
Discussion
I denna presentation illustrerade vi hur du använder spirande jästsvampen Saccharomyces cerevisiae som en heterolog system för uttrycket av typ III bakteriella effektor proteiner och hur man identifierar effektor-inducerad fenotyper tillväxthämning. Viktigt kan dessa fenotyper utnyttjas i genetisk skärmar för att identifiera dämpning av de negativa effekterna av effektenheter på jäst tillväxt. Dämpning kan representera antingen direkt mål av effektor studerat eller proteiner som deltar i cellulära…
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Israel Science Foundation.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Yeast extract | Difco | 212750 | ||
| Peptone | Difco | 211677 | ||
| D-glucose | Sigma | G5767 | ||
| Agar | Difco | 214010 | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | S8045 | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | ||
| Yeast synthetic drop-out medium supplement | Sigma | Y2001 | ||
| D-galactose | Sigma | G0750 | >99%; <0.1% glucose | |
| D-raffinose | Sigma | R0250 | >98% | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | ||
| Uracil | Sigma | U0750 | ||
| L-tryptophan | Sigma | T0254 | ||
| L-histidine | Sigma | H6034 | ||
| DNA, single stranded, from salmon testes | Sigma | D7656 | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | Desiccate | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | H1758 | ||
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma | P4338 | ||
| Lithium acetate (LiAc) | Sigma | L4958 | ||
| Tris (base) | J.T. Baker | 4109-02 | ||
| Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E5134 | ||
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | ||
| Glycerol | Sigma | G5516 | ||
| Bromophenol blue | Sigma | B6131 | ||
| Dodecyl sulfate sodium salt (SDS) | Merck | 8.22050.1000 | ||
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430052 | Sterile | |
| Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm) | Sarstedt | 67.742 | ||
| Inoculation loop | Sigma | Z643009 | Sterile | |
| Parafilm | Sigma | P7543 | ||
| pH indicator strip, pH 6.5-10.0 | Merck | 1.09543.0001 |
References
- Siggers, K. A., Lesser, C. F. The yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins. Cell Host Microbe. 4, 8-15 (2008).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat. Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Munkvold, K. R., Martin, M. E., Bronstein, P. A., Collmer, A. A survey of the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion system effector repertoire reveals several effectors that are deleterious when expressed in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 490-502 (2008).
- Curak, J., Rohde, J., Stagljar, I. Yeast as a tool to study bacterial effectors. Curr. Opin. Microbiol. 12, 18-23 (2009).
- Slagowski, N. L., Kramer, R. W., Morrison, M. F., LaBaer, J., Lesser, C. F. A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins. PLoS Pathog. 4, e9-e9 (2008).
- Huang, J., Lesser, C. F., Lory, S. The essential role of the CopN protein in Chlamydia pneumoniae intracellular growth. Nature. 456, 112-115 (2008).
