在这里,我们描述了一个基本的协议,以图像和量化现场后,转染哺乳动物组织培养细胞的有丝分裂的时机。
蜂窝组织和染色体在有丝分裂过程中发生的动态变化是紧密协调,以确保准确的基因和细胞内容继承。有丝分裂,如染色体运动的标志性赛事,可以很容易地跟踪单个单元格,使用时间推移,哺乳动物细胞表达特定的蛋白GFP标记线的荧光显微镜的基础上。结合RNAi为基础的枯竭,这可能是一个功能强大的方法,针对后一种特定的蛋白质的水平已经降低缺陷发生有丝分裂阶段(S)。在这个协议中,我们提出了一个消耗上有丝分裂的时机的一个潜在的有丝分裂调控蛋白的效果评估的基本方法。是与siRNA的转染细胞,放置在舞台上方的孵化室,和使用自动荧光显微镜成像。我们介绍了如何使用软件设置一个失效时间的实验中,如何处理图像序列,使静止图像的蒙太奇或电影,以及如何量化和分析有丝分裂阶段使用一个细胞系表达的时序mCherry标记组蛋白H2B。最后,我们讨论设计一个时间推移实验的重要因素。这种策略是其他方法的补充和提供的优势1)在寻找作为一个人口和2)分析有丝分裂的细胞,而不需要使用药物治疗的细胞周期同步时,可能无法观察到的动力学变化的敏感性。从这样的成像实验的视觉信息不仅可以使有丝分裂的子阶段进行评估,而且还可以提供意想不到的洞察力,不会明显流式细胞仪细胞周期分析。
在成像和荧光蛋白技术的最新进展,实时成像已经成为常规的细胞分析2方面。一个各种绿色荧光蛋白(和其他颜色的变种3)标签蛋白被广泛使用或相对容易构造的,可以用来追踪一个细胞分裂的标志,包括DNA / 染色体的动态4,5,中心体复制,细胞周期蛋白B动态7,核信封细分和重组8,9,10有丝分裂纺锤体的形成, 胞质 11的各个阶段。标签蛋白,可单独或联合使用时的激发/发射光谱,荧光标记是兼容的,允许特定事件之间的协调,以进行评估。如果更大的空间和/或时间分辨率/所需,是否可以使用激光扫描,旋转盘,或共振扫描共聚焦显微镜,并与日益增加的分辨率复杂的显微镜选项列表中继续增长。在哺乳动物细胞的有丝分裂的实时成像也已适应在高通量的RNAi和小分子屏幕12-14使用。因此,一个S最初的实验中,使用这种技术,而可能是相对简单的,这一战略的基础上的可能性是多方面的。
这项工作是由美国癌症协会(PF – 07 – 103 – 01 – CSM),美国国立卫生研究院(R01 GM61275和P30 CA042014),白血病和淋巴瘤协会,Huntsman癌症基金会的支持。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | ||
Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well) | Thermo Scientific | 12-565-337 | Additional chamber sizes are available | |
Fibronectin | Sigma | F1141 | ||
Stage-top cell incubator | OKO Lab | Can use any appropriate chamber | ||
Automated inverted fluorescence microscope | Olympus | Can use any appropriate microscope | ||
Software package | Metamorph | Can use any appropriate software |