השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric
Summary
אנו להדגים פרוטוקול ליצור עוברי דג הזברה chimeric להתנהגות הדמיה לחיות הסלולר במהלך embryogenesis.
Abstract
תאים לשנות בהרחבה במקומות ורכושם במהלך embryogenesis. שינויים אלה מוסדר על ידי יחסי הגומלין בין התאים לבין סביבתם. עוברים chimeric, אשר מורכב של תאים בעלי רקע גנטי שונה, הם כלי נהדר ללימוד תאים תאים אינטראקציות בתיווך גנים של עניין. השקיפות של דג הזברה העובריים בשלבים התפתחותיים מוקדם היתרי להדמיה ישירה של המורפוגנזה של רקמות ואיברים ברמה התאית. הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול ליצור הרשתיות chimeric והמוח עוברי דג הזברה ולבצע הדמיה חיה של תאים התורם. פרוטוקול מכסה את הכנת מחטים ההשתלה, השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים התורמות GFP שלילי המארחים, ועל בחינה של התנהגות תורם התא תחת מיקרוסקופ confocal לחיות. עם שינויים קלים, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי ללמוד את ההתפתחות העוברית של רקמות ואיברים אחרים דג הזברה. היתרונות של שימוש GFP לתאי התורם התווית הם דנו גם.
Protocol
Discussion
בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה blastomere השתלת לנתח את התפתחות המוח ואת רשתית דג הזברה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לנתח את ההתפתחות של רקמות ואיברים אחרים, פשוט על ידי שחרור בלסטומרים התורם למקומות המתאימים את העוברים המארח. תיוג עם מולקולות ה-GFP התשואות רקע נקי יותר עם תי?…
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) Core גרנט (5P30EY008098) וקרנות הבאים XW: NIH גרנט R01EY016099 מחקר למניעת עיוורון בפרס פיתוח קריירה. אנו מודים לתרופ קירה לסיוע הדמיה confocal.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5 ¾” Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-30 | ||
| Borosilicate Glass Capillary | WPI (World Precision Instruments, Inc.) | 1B100F-4 | ||
| FluoroDish | WPI | FD35 | ||
| Vertical Needle / pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 720 | ||
| Micro Grinder | Marishige | EG-400 | ||
| Micro Forge | Marishige | MF-830 | ||
| Manual Microsyringe Pump | WPI | MMP | ||
| Forceps | Fine Science Tools | 11232-20 | ||
| Hydrofluoric Acid | Fisher Scientific | A147-1 | ||
| Penicillin- Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | ||
| Agarose | RPI (Research Products International Corp.) | 9012-36-6 | ||
| Low melting agarose | Fisher Scientific | BP165-25 |
E3 egg water:
- 5 mM NaCl
- 0.17 mM KCl
- 0.33 mM CaCl2
- 0.33 mM MgSO4
- 0.1% methylene blue
References
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348, 728-730 (1990).
- Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina. Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).
