Animale tappi iperespressione del gene prodotto (s) sono trapiantati al fianco di sviluppo Xenopus laevis Embrioni al fine di stabilire se il tessuto è determinata.
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Articolo metodologico
Determinazione del tessuto Utilizzando il trapianto Cap animali (ACT) Assay in Xenopus laevis
In questo articolo
Sommario
Abstract
Molte proteine svolgono un duplice ruolo nello sviluppo embrionale. Quelle che regolano il destino determinazione delle cellule in un tessuto specifico può anche influenzare lo sviluppo di una regione più ampia dell'embrione. Questo rende la definizione del suo ruolo in un tessuto particolare difficile da analizzare. Per esempio,
Protocollo
Parte I. Set-up per l'analisi ACT
- Generare RNA ricoperto per iniezione come suggerito dal produttore, usando il loro fenolo: cloroformio metodo di purificazione (es. mMessage mMachine Kit; Applied Biosystems / Ambion, Austin, TX). RNA che codifica per una proteina fluorescente viene usato come tracciante. Trascriviamo sia proteina fluorescente gialla (YFP) o mCherry 5 cDNA, che si trova in un vettore di espressione pCS2 +.
- Tirare tubi in vetro borosilicato capillari per formare punte di vetro affusolata con un estrattore micropipetta. Noi usiamo Sutter Micropipetta Puller, P-97 (Sutter Instruments, Inc., Novato, CA), come descritto in ....
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Discussione
In questo video, abbiamo dimostrato la nostra versione di tecniche classiche utilizzate dai biologi Xenopus, che noi ruotare per ottenere il tappo test animali trapianto. A temperatura ambiente, embrioni di Xenopus sviluppano molto rapidamente attraverso le fasi 9 e 15. Ponendoli a 14 ° C, lo sviluppo dell'embrione viene rallentato e trapianti di molti altri possono essere eseguite in un esperimento. Se è necessario far crescere gli embrioni a stadi vecchi (> 42/43), poi si consiglia di utilizza.......
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Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti di ricerca per la Prevenzione della Cecità (Career Development Awards di MEZ e ASV e un finanziamento non vincolante per il Dipartimento di Oftalmologia), la Fondazione E. Matilda Zeigler (MEZ e ASV) e il National Eye Institute / NIH (MEZ , borse di studio e R01EY015748 R01EY017964).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit mMessage mMachine SP6 | Applied Biosystems | AM1340 | |
| Tubi capillari in borosilicato (1,0 mm di diametro esterno x 0,5 mm di diametro interno) | FHC, Inc. | 27-30-1 | |
| Tiratore di micropipette Sutter | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Solfato di gentamicina [50 mg/ml] | Fisher Scientific | BW17-528Z | |
| Kit Sylgard/elastomero 1,1 lb | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| Piatto di Petri in polistirene 60 x 15 mm | USA Scientific, Inc. | 8609-0160 | |
| gonadotropina corionica umana | Intervet Inc. | 22219 | |
| Sistemi di microiniezione Pico-Injector | Harvard Apparatus | 650003 | |
| Incubatore Torrey Pines Scientific ECHOtherm | Fisher Scientific | 11-680-21 | |
| Pipetta di trasferimento | Krackeler Scientific, Inc. | 6290-20635A | |
| Pinzette Dumostar n. 5 | Fisher Scientific | 11295-10 |
Riferimenti
- Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
- Lamb, T. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science. 262
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Ristampe e permessi
