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Neuroscience

아밀로이드 β 단백질, 알츠하이머 병의 원인이되는 에이전트에 대한 Aptamers의 선택

Published: May 13, 2010
doi:
10.3791/1955
,
1Department of Neurology,David Geffen School of Medicine, 2Molecular Biology Institute,University of California, Los Angeles, 3Brain Research Institute,University of California, Los Angeles

Summary

Aptamers는가 선택한 짧은 ribo-/deoxyribo-oligonucleotides 아르<em> 체외 수정</em> 특정 대상에 대한 친화력을 바탕으로 진화 방법. Aptamers는 다양한 치료, 진단 및 연구 애플 리케이션과 분자 인식 도구입니다. 우리는 아밀로이드 β 단백질, 알츠하이머 질병의 원인이되는 에이전트 aptamers의 선정 방법을 보여줍니다.

Abstract

알츠하이머 병 (AD 1)의 presymptomatic 진단이 어려운 렌더링 교활한 코스와 진보, 나이 의존, neurodegenerative 무질서이다. 확실히 AD 진단 따라서 광고의 presymptomatic, 조기 진단이 효과적인 치료법 2,3를 개발하고 관리를 위해 중요합니다 수립, 오직 사후 이루어진다.

아밀로이드 β – 단백질 (Aβ) 광고 pathogenesis의 중심이다. 가용성, oligomeric Aβ 어셈블리는 AD 4,5에서 neurotoxicity 기본 시냅스 기능 장애 및 신경 세포 손실에 영향을 믿고 있습니다. 수용성 Aβ 어셈블리 다양한 형태의이 설명되었습니다, 그러나, 그들의 상호 관계 및 광고의 병인 및 pathogenesis 관련성 복잡하고 잘 이해 6되지 않습니다. 특정 분자 인식 도구는 Aβ 어셈블리 사이의 관계를 해명하고 증상이 등장하기 전에 초기 질병 과정에서 이러한 어셈블리의 탐지 및 특성을 촉진 수도 있습니다. 분자 인식은 일반적으로 항체에 의존합니다. 그러나, 분자 인식 도구, aptamers의 대체 수업은 항체 7,8에 비해 중요한 이점을 제공합니다. 지수 농축 (SELEX) 9,10하여 리간드의 체계적 발전 : Aptamers는 체외 수정이 선택에 의해 생성 oligonucleotides 있습니다. SELEX는 다원 진화와 마찬가지로, 수, 그 반복 과정을 선택, 증폭, 강화, 그리고 재산의 영구화, 예를 들어, 아비드, 특정 리간드 바인딩 (aptamers) 또는 촉매 활동 (ribozymes 및 DNAzymes).

현대 생물 공학 및 의학 11 도구로 aptamers의 출현에도 불구하고, 그들은 아밀로이드 분야에서 underutilized되었습니다. 몇 RNA 또는 ssDNA의 aptamers은 프리온 단백질 (PrP) 12-16의 다양한 형태에 대한 선택되었습니다. 재조합 보빈 PrP에 대해 생성되는 RNA aptamer는 아밀로이드 원섬유 18 양식 전체 길이 PrP의 가용성, oligomeric, β – 시트 풍부한 conformational 변형, 보빈 PrP – β 17 인식 표시되었다. Aptamers 2 – microglobulin (β 2m)는 β 2m 원섬유 19 이외의 다른 특정 amyloidogenic 단백질 원섬유를 바인딩하는 찾았습니다 원섬유의의 β의 monomeric 여러 양식을 사용하여 생성되었습니다. Ylera 외. 고정 monomeric Aβ40 20에 대한 선택의 RNA aptamers를 설명했다. 예기치이 aptamers은 원섬유의 Aβ40을 바운드. 모두,이 데이터는 몇 가지 중요한 질문을 올립니다. 왜 monomeric 단백질에 대한 선택 aptamers는 고분자 형태를 인식나요? amyloidogenic 단백질의 monomeric 및 / 또는 oligomeric 형태에 대한 aptamers를 얻을 수 있을까요? 이러한 질문을 해결하기 위해, 우리는 사진을 유발 가교 수정되지 않은 단백질 (PICUP) 22,23을 사용하여 생성된 covalently – 안정 oligomeric Aβ40 21 aptamers를 선택하려했습니다. 이전 결과 17,19,20 마찬가지로, 이러한 aptamers 가능성이 높습니다 aptatope 21 구조 잠재적으로 일반적인 아밀로이드를 인식 Aβ와 기타 여러가지 amyloidogenic 단백질의 원섬유과 반응. 여기, 우리는 이러한 aptamers 21 생산에 사용 SELEX 방법론을 제시한다.

Protocol

1 부 : 단백질 준비와 교차 연결 처음 SELEX에 사용되는 단백질이로 이전 23 설명한 균질, 집계없는 준비를 얻기 위해 1,1,1,3,3,3 – hexafluoro – 2 – 프로파놀 (HFIP)와 pretreated 있습니다. 이 단계는 미리 형성 합산은 가난한 실험 재현성 24 결과 amyloidogenic 단백질의 신속한 집계를 유발하기 때문에 필요하며, 단백질의 unaggregated 아닌 원섬유의 형태 aptamers의 선택을 위해 바?…

Discussion

SELEX 과정의 출발점은 일반적으로 10 12 -10 15 시퀀스를 포함하는 임의의 oligonucleotide 라이브러리의 합성이다. RNA SELEX에서, 여기를 시연 반면 DNA SELEX,이 라이브러리가, ssDNA 수영장이 생성된 후 직접 사용, ssDNA 라이브러리는 체외 수정의 전사에 의해 효소 RNA 수영장 최초로 변환됩니다. 각각의 사이클은 노출과 의도한 대상으로 oligonucleotides의 바인딩을 구성되어 의하여 다음, S…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 보건의 캘리포니아학과에서 NIH / NIA와 07-65798에서 부여 AG030709 지원했다. 우리는 펩타이드의 합성과 아미노산 분석, 도움 및 프로젝트 지원 및 시약을 제공하는 박사 치 – 홍콩 B. 첸의 초기 단계를 지원하는 박사 엘리자베스 F. 네펠드, 박사 앤드류 D에 대한 마가렛 M. 콘드론을 인정 도움이 토론을 위해. 엘링턴.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Aβ40   UCLA Biopolymers Laboratory   Lyophilized powder
MX5 Automated-S Microbalance   Mettler Toledo    
Silicon-coated, 1.6-ml tubes   Denville Scientific C19033 or C19035  
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP)   TCI America H0424 Use in a fume hood.
Ammonium persulfate   Sigma A-7460 Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h.
Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate   Sigma 224758-1G Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h.
Dithiothreitol (DTT)   Sigma 43815  
D-Salt™ Excellulose™ desalting columns   Thermo Scientific 20449  
Ammonium acetate   Fisher Scientific A637-500  
Silicon-coated, 0.6-ml tubes   Denville Scientific C19063  
Novex Tricine Gels (10–20%)   Invitrogen EC6625B0X 10-well; mini size (8 cm X 8 cm); 25 μl loading volume per well; separation range 5 kDa to 40 kDa
Quartz cuvette   Hellma 105.250-QS  
Beckman DU 640 spectrophotometer   Beckman    
ssDNA library   Integrated DNA Technologies Custom-ordered The library was designed to contain 49 random nucleotides flanked by two constant regions containing primer-binding and cloning sites: 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3′
Taq DNA polymerase   USB Corporation 71160 Recombinant Thermus aquaticus DNA Polymerase supplied with 10× PCR Buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2 for routine PCR.
PCR Nucleotide Mix, 10 mM solution   USB Corporation 77212 (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Forward primer   Integrated DNA Technologies Custom-ordered 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3′
Reverse primer   Integrated DNA Technologies Custom-ordered 5′-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3′
Thermal cycler   Denville Scientific Techne TC-312  
QIAquick PCR Purification Kit (50)   QIAGEN 28104  
Agarose   Denville Scientific CA3510-8  
Conical, sterile 1.6-ml tubes with caps attached with O-rings   Denville Scientific C19040-S  
RiboMAX™ Large Scale RNA Production System–T7   Promega P1300 The kit contains: 120 μl Enzyme Mix (RNA polymerase, recombinant RNasin® ribonuclease inhibitor and recombinant inorganic pyrophosphatase); 240 μl transcription 5 buffer; 100 μl each of 4 rNTPs, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/μl; 10 μl linear control DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M sodium acetate (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water
α-32P-cytidine 5′-triphosphate, 250 μCi (9.25 MBq),   Perkin Elmer BLU008H250UC Specific Activity: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6)
Citrate-saturated phenol:chloroform:isoamyl alcohol (125:24:1, pH 4.7)   Sigma (Fluka) 77619  
Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1)   Sigma C0549  
Absolute ethanol for molecular biology   Sigma E7023  
Z216-MK refrigerated microcentrifuge   Denville Scientific C0216-MK  
illustra ProbeQuant™ G-50 Micro Columns   GE Healthcare Obtained from Fisher Scientific (45-001-487) Prepacked with Sephadex™ G-50 DNA Grade and pre-equilibrated in STE buffer containing 0.15% Kathon as Biocide
Triathler Bench-top Scintillation counter   Hidex Oy, Turku, Finland Triathler LSC Model: 425-034  
Novex® TBE-Urea Sample Buffer (2×)   Invitrogen LC6876  
6% TBE-Urea Gels 1.0 mm, 10 wells   Invitrogen EC6865BOX  
Novex® TBE Running Buffer (5×)   Invitrogen LC6675  
Radioactivity decontaminant   Fisher Scientific 04-355-67  
Gel-loading tips   Denville Scientific P3080  
XCell SureLock Mini-Cell   Invitrogen EI0001 XCell SureLock Mini-Cell
Autoradiography film   Denville Scientific E3018 Use in complete darkness
Autoradiography film, Hyperfilm™ ECL   Amersham Biosciences RPN3114K Can be used under red safe light.
Membrane discs   Millipore GSWP02500 Mixed cellulose ester, hydrophilic, 0.22-μm disc membranes
Fritted glass support base for 125-ml flask   VWR 26316-696  
Petri dishes   Fisher Scientific 08-757-11YZ  
Urea   Fisher Scientific AC32738-0050  
EDTA   Fisher Scientific 118430010  
Glycogen   Sigma G1767  
2-Propanol for molecular biology   Sigma I9516  
Recombinant RNase inhibitor   USB Corporation 71571  
ImProm-II™Reverse Transcription System   Promega A3802  
Recombinant RNase inhibitor   USB Corporation 71571  
RapidRun™ Loading Dye   USB Corporation 77524  
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References

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Rahimi, F., Bitan, G. Selection of Aptamers for Amyloid β-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (39), e1955, doi:10.3791/1955 (2010).
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