Märkning och celler Imaging i zebrafisk Hindbrain
Summary
Nyckeln till att förstå morfogenetiska processer som formar det tidiga embryot är förmågan att bilden celler med hög upplösning. Vi beskriver här en teknik för märkning av enskilda celler eller små grupper av celler i hela zebrafisk embryon med membran riktade-grönt fluorescerande protein.
Abstract
Nyckeln till att förstå morfogenetiska processer som skapar den tidiga ryggradsdjur embryot är förmågan att bilden celler med hög upplösning. I zebrafisk embryon, injektion av plasmid-DNA resulterar i mosaik uttryck, vilket möjliggör visualisering av enskilda celler eller små grupper av celler<sup> 1</sup>. Vi beskriver hur injektion av plasmid-DNA-kodning membran riktade grönt fluorescerande protein (mGFP) under kontroll av en allestädes närvarande promotor kan användas för avbildning celler genomgår neurulation. Centralt i detta protokoll är en metod för avbildning märkta celler med hög upplösning i sektioner och dessutom i realtid. Detta protokoll innebär injektion av mGFP DNA i unga zebrafisk embryon. Embryon bearbetas sedan för vibratome sektionering, antikroppar märkning och avbildning med en konfokalmikroskop. Alternativt kan leva embryon uttrycka mGFP kan avbildas med time-lapse konfokalmikroskopi. Vi har tidigare använt denna okomplicerad metod för att analysera de cellulära beteenden som driver neuralrörsdefekter bildning i hindbrain regionen zebrafisk embryon<sup> 2</sup>. Den fasta förberedelser tillåtet för oöverträffad visualisering av celler former och organisation i neuralröret medan levande bildåtergivning kompletteras denna metod möjliggör en bättre förståelse av de cellulära dynamik som sker under neurulation.
Protocol
Discussion
Sammanfattningsvis beskrev etiketteknik här möjliggör enskild cell analys av morfogenetiska processer i zebrafisk embryot. Det primära fokus i detta protokoll om metoder för avbildning märkta celler i neuralröret med mGFP under kontroll av en allestädes närvarande promotor. För ytterligare tillämpningar av denna övergående läsare uttryck analys bör hänvisa till en färsk uppsats av Andersen et al. 3.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av en NIH bidrag som beviljas till R. Brewster (1R01GM085290-01A1).
Materials
Solutions
- Hank’s Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H2O
- Hank’s Stock #2: 0.358 g Na2HPO4 Anhydrous, 0.60 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O
- Hank’s Stock #4: 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
- Hank’s Stock #5: 1.23 g MgSO4x7H2O in 50 ml dd H2O
- 1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3
- Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)
References
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish Practical approach series. , (2002).
- Hong, E., Brewster, R. N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish. Development. 133, 3895-3905 (2006).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J Vis Exp. , (2010).
