Förfarandet beskriver vi fokuserar enbart på IM-MS-analys av protein komplex. Därför föreslår vi att forskarna obekant med området strukturella MS Se stegen provberedning, instrumentkalibrering och MS och tandem MS optimering som beskrivs i Kirshenbaum et al. 2009 http://www.jove.com/index/details. STP? ID = 1954. I allmänhet innebär detta protokoll låga mikromolära koncentrationer av komplexa (1-20 M) i en flyktig buffert som ammoniumacetat (0,005 – 1 m, pH 6-8). Med tanke på att 1-2 l förbrukas per nanoflow kapillär, föreslår vi 10-20 l som ett minimum volym, för att möjliggöra optimering av MS villkor. Del 1: Förvärva ett jon rörlighet-masspektrometri spektrum Ställ masspektrometer på följande driftlägen: Mobility-TOF, positiv jon förvärv, och V-läge. Slå på alla gaser (API, Trap och IMS). Vi använder N 2 för IM separation, och Ar för Trap / Transfer. Rekommenderad initial värden är 1,5 ml / min för Trap regionen och ett gasflöde på 24 ml / min för IMS-enheten. Ställ m / z förvärvet sortiment. För ett okänt protein komplex, föreslår vi att första användningen av en bred massa sortiment, som sedan kan reduceras till önskade värden. Parallellt justera MS profilen för maximal verkningsgrad. För stora komplex, bör förvärvet viktområde ställas in från 1.000 – 32.000 m / z, och medlemsstaterna profil på Auto. Annars kan profilen ställas in, enligt följande tabell: m / z bo (%) ramp (%) 960 10 20 3200 30 40 10.667 Kontrollera RF-inställning och, om nödvändigt, anpassa sig till värden lämpliga för stora proteinkomplex, sålunda: Källa Trap IMS Överföring RF Offset 450 380 380 380 RF Gain 0 0 0 0 RF-Limit 450 380 380 380 Applicera kapillär spänning (1,050-1,400 V) och låg nanoflow tryck (från 0,00 till 0,03 bar). När spray är initieras, försöka minska nanoflow trycket till ett mycket lågt värde. Dessutom, justera placeringen av kapillär, med avseende på konen. Justera MS förvärvet parametrarna, att förvärva en väl löst MS spektrum: det tryckgradienten längs instrumentet och provtagning konen samt utvinning konen bör bias, Trap och Transfer potentiella inställningarna, allt optimeras (beskrivna i det JUPITER-protokollet Kirshenbaum et al. 2009 http://www.jove.com/index/details.stp?ID=1954). Även om dessa parametrar är prov-beroende, är de villkor som vi använde för att skaffa MS spektra av olika jon massa från peptid till protein komplex, beskrivs i tabell 1 (se även bild. 1). För att minimera aktiveringen av de komplexa försöker att gradvis minska (i steg om ~ 10 V) provet konen, Trap och bias spänning utan att ändra position topp. När en optimal masspektrum erhålls drivan tidsprofil bör justeras. Vid analys av protein församlingar optimala förutsättningar för både vikt och mått rörlighet är ofta oförenliga, och därför är det viktigt att hitta den rätta balansen mellan de två. Sammantaget bör jon rörlighet tomten optimeras så att topparna är fördelade över hela glida tidsintervall och maximal profilen är slät, närmar sig en normalfördelning (Fig. 2A, 2B). Betydande topp asymmetri kan relateras till dålig separation av flera konformationer. Som regel kan tre parametrar, T-våg hastighet, T-våghöjd och IMS Gasflödet ställas in för att optimera rörlighet separation. Öka T-vågen hastigheten kommer att bredda glida profilen tiden distribution, samtidigt som ökad T-våghöjd värden kommer att minska det. På samma sätt kommer att öka IMS gasflödet skifta profil glida tiden mot högre värden (den minimala IMS gasflödet skall vara 10 ml / min). Vi föreslår att lämna två av de tre fasta tillgängliga variabler, och optimera den tredje tills IM spektrum är väl löst (Fig. 2B). För detta ändamål ställa T-vågen hastighet och gasflödet till 250 m / s och 24 ml / min, åternebulosans. Då, som en utgångspunkt, som T-våghöjden till 3 V och, i flera steg, öka den i 1 V steg. I allmänhet kommer större joner kräver högre våghöjder. Vanligtvis finns det ingen anledning att ändra IMS-trycket, men är då höga partiskhet spänning som krävs för trimning, minska IMS gasen kommer att möjliggöra en minskning av partiskhet spänning och därmed en minskning av proteinkomplex aktivering. Sammantaget kan maximal upplösning på 10-12 ton / Dt nås. När förhållandena inte är optimerade (låg T-våghöjd eller hög T-våg hastighet och / eller högt IM tryck), kommer jonerna färdas inte genom IM-enheten effektivt, och resan kan ta längre tid än den tid som krävs för nästa jon paket som ska ut i rörlighet cellen. Som ett resultat kommer en ny jon paket släppas ur fällan regionen innan föregående paket har levererats till pusher regionen. Detta kommer att leda till en "roll-over" effekt, där topp observeras i den första delen av avdrift tiden spektrumet är identisk med den i joner i avfallsdammen kanten (Fig. 2C). Denna artefakt kan elimineras genom att öka T-våghöjden, och minskar T-vågen hastighet och IMS tryck. Dessutom kan Trap frigöra tid justeras. Dessutom är det viktigt att validera att överföringen T-våghöjden är satt till minst 5 V. För att förhindra läckage av joner mot IMS-cellen, rekommenderar vi att rörligheten fällan höjden hållas på högsta tillåtna halter (30 V). Låg hastighet och hög amplitud Transfer T-vågor kan leda till "porlande" av drift tid Distribution Profile (Fig. 2D). Denna artefakt uppstår när rörligheten separation av joner (jon ankomst / drift tid) inte upprätthålls genom överföring och regioner SP, på grund av partiella synkronisering mellan pusher frekvens och överföring T-vågen hastighet. För att eliminera denna effekt, antingen pusher tid eller Transfer T-vågen hastigheten justeras. Eftersom pusher frekvensen är relaterad till massan sortiment, kan denna artefakt visas igen när denna parameter ändras. T-våghöjd utövar en mindre effekt, även om dess minskning kan också bidra till att eliminera ringar på vattnet. När de ovan nämnda parametrar har optimerats, kan IM-MS uppgifterna hämtas. Del 2: Screening experimentella förhållanden för att säkerställa rörlighet mätningar av infödda strukturer För att uppnå mycket löst MS toppar, är proteinkomplex ofta aktiveras inom masspektrometer, för att främja strippning av kvarvarande vatten och komponenter buffert 11. Men om aktiveringsenergi höjs över ett tröskelvärde, kan delvis utspelas förmås att bilda flera mellanliggande stater 12, som förmodligen inte att motsvara de infödda, lösning state struktur (Fig. 3A-C). Som ett resultat kan glida tiden topp flyttas och breddas, vilket speglar den heterogena befolkningen i ovikt strukturer. För att få fram uppgifter glida tid överensstämmer med lösning-fas strukturer är det viktigt att noggrant kontrollera de spänningar som används för att accelerera joner, innan IM separation. Dessutom för hög ms upplösning det är bättre att öka överföringen snarare än Trap spänning. Som IM-enheten är placerad, först, följt av överlåtelsen regionen och TOF analysator, därav följer aktivering IM mätning och jonerna förblir opåverkad, medan MS noggrannheten kan ökas. För att kontrollera att datainsamling sker under förhållanden som behåller den ursprungliga strukturen av komplexa, rekommenderas att data registreras över en rad experimentella och lösning villkor, snarare än enligt en enda, optimerad uppsättning parametrar: Öka kapillär och konen spänningar i flera steg, medan övervakningen av effekten på drift tid spektrumet. Som i steg 1, öka spänningen Trap kollision i flera steg och få uppgifter vid 10 V mellanrum. För att identifiera ovikt konformationer och bedöma de förvärvade data manuellt framkalla dissociation av proteinkomplex genom upptitrering av provet med ättiksyra över en vidd av pH 2-7, och registrera data (Fig. 3B). Del 3: Korrelera mellan värderingar glida tid och tvärsnittsareor Till skillnad från konventionella IM mätningar, där den uppmätta drift tidsvärden är linjärt relaterade till Ω, i T-vågen IMS-system är tvärsnittsarea definieras av en kalibrering strategi. Således, snarare än ett absolut mått, är en relativ exponentiell korrelation uppstår mellan den uppmätta driver gånger och Ω 1,13: där t D är den uppmätta drift tid, och X är andelen konstant som kan utvinnas ur en kalibreringskurva. Kalibreringen är utföraED genom att mäta drift tider av joner med kända Ω (mätt från konventionellt IM experiment). Drift tid mätningar kalibreras med hjälp denatureras proteiner häst cytokrom C, häst hjärta myoglobin och nötkreatur ubiquitin med kända kollision-tvärsnitt. För detta ändamål lösningar av 10 mikrometer i 49/49/2, volym förhållandet, bör vatten / metanol / ättiksyra vara beredd (reagenser beskrivs i tabell 3). Förvärva IM-MS data för kalibreringsvätska proteiner under exakt samma instrument villkor för målet protein eller proteinkomplex: (Del 1). Alla spänningar och värden trycket bör vara identiska, för att bevara IM separation inställningar. För varje laddningstillstånd för kalibreringsvätska proteiner extrahera experimentella värdet glida tiden (t D) (beskrivs i del 4). Korrekt varje kalibreringsvätska drift gånger (t D) (tabell 2) med hjälp av följande ekvation: , Där m / z är massan och laddning förhållandet mellan observerade jon, och c är Enhanced Driftscykel (EDC) fördröjning koefficienten 1. Dess värde, vanligtvis mellan 1,4 och 1,6, är instrument-beroende. EDC-värdet visas i systemet | Förvärv Inställningar | Acquisition Setup fliken. Använda professor David Clemmer tvärsnitt Database: http://www.indiana.edu/ ~ Clemmer / Forskning / cross% 20section% 20database/Proteins/protein_cs.htm 14 rätt varje kalibreringsvätska tvärsnitt för både jon laddningstillstånd och minskad massa. , Där Ω C är den korrigerade tvärsnitt är Ω litteraturen tvärsnitt är z jon laddningstillstånd, M är molekylvikt kalibreringsvätska jon, och M G är molekylvikt IM bakgrunden gas (vanligtvis N 2). Tomt I (t D) mot I (Ω C) (Fig. 4A). Den resulterande kurvan motsvarar följande ekvation: Parametrarna X och A kan utvinnas genom att montera tomten till ett linjärt samband. Lutningen X motsvarar den exponentiella andelen faktor och en representerar den passar bestämda konstant. Beräkna passar korrelationskoefficienten r 2, med hjälp av Pearsons ekvation: . Godtagbara värden för r 2 är större än 0,95 (Fig. 4B). Ett lägre korrelationskoefficient värde kan bero på: Ofullständig utbredning av proteinet kalibreringsstandarderna. Detta kommer att leda till topp bredda på grund av den heterogena sammansättning av mellanliggande stater. Enligt vår erfarenhet kan en äldre prov försämras IM spektra. Olika experiment som används för de olika kalibreringsstandard proteiner. I det här fallet plotta data för varje protein separat bör generera olika korrelationskoefficienter, om var och en av dem bör vara högre än 0,95. Noisy data och felaktiga utjämning och centrering av drift tid distributionen. Räknefel. Recorrect den kalibreringsvätska glida tiden med fastställda exponentiell faktor X, härrör i steg 7: Som en validering steg Replot Ω C vs och definiera korrelationskoefficienten. Högre värden än 0,95 är att vänta. Enligt det förfarande som beskrivs i steg 4, korrigera den uppmätta glida tiden för målet protein eller proteinkomplex: Kalibrera drift tiden för målprotein / proteinkomplex med hjälp av exponentiell faktor X, som definieras i Steg 7: Beräkna Ω av målet protein / protein komplex med plats bestämd konstant, A, som definieras i Steg 7: . För varje experimentell skick, 2 till 13 steg ska upprepas. När man definierar tvärsnittsarea det okända protein eller proteinkomplex, rekommenderar vi att varje försök att upprepas minst tre gånger, och standardavvikelsen för dessa tre exemplar bestämda. Del 4: Definiera värden glida tid Obligatorisk programvara: MassLynx och Driftscope (vatten). Öppna IM-MS spektrat med Driftscope programvara. Från huvudmenyn, välj ViEW och avmarkera Kromatogram, Drift Tid och Spectrum (tillval), vilket endast aktiv 2D-kartan visar glida tid vs m / z. Från menyraden, välj Visa | Alternativ | Visa Redaktör Panel och justera värdena intensitet Tröskeln för att minimera bakgrundsljud (i de flesta fall kan denna inställning definieras som Min = 30-40% och Max = 100 räknas%). Välj Visa | 2D Skala Karta intensitet och tre alternativ visas: linjär skala, Logga Skala och Square Root Skala. Ett urval av Log Scale (logaritmisk uppgifter transform) komprimerar koden intensitet färg och möjliggöra samtidiga ett brett utbud av intensiteter (i motsats till den linjära och kvadratrot alternativ, som endast de mest intensiva topparna blir synlig) . Från verktygsfältet panelen, Använd knappen Selection Tool. Detta alternativ kommer att aktivera de olika valmöjligheter, och aktivera urval av de berörda regionen inom spektrumet. Den mest exakta verktyget är Aktivera regionen av intresse val, genom vilka en gräns kan dras runt om i regionen av intresse, och därmed utesluter alla onödiga data och toppar buller. Likaså Ortogonal och Band Val alternativen är bra, då regionen av intresse inte är omgiven av redundanta toppar. När regionen av intresse är vald, använd Acceptera Aktuella Urval kommando för att ta bort onödig information. Exportera data till MassLynx, men behåller informationen glida tiden. Inom MassLynx, öppna kromatogrammet för den sparade glida tid spektrum, och kombinera den tiden papperskorgar. Motsvarande masspektrum öppnas automatiskt. Applicera smoothening funktionen genom att definiera fönstrets storlek och antal smidig parametrar (bör anpassas specifikt för varje spektrum, med minimal värden). Applicera baslinjen subtraktion, om det behövs. Centrera spektrum och mäta massan, att validera protein identitet och massa noggrannhet. För varje laddningstillstånd, kombinera med m / z sortiment. Motsvarande driver tiden spektrum visas automatiskt. Smidig och centrera glida tiden profil och definiera värdet glida tiden genom att ange centroiden för varje topp. Del 5: representativa resultat Figur 1. Schematisk representation av Synapt HDMS instrumentet som visar de stora avstämbara parametrar för IMS-MS förvärvet. Experimentella parametrar som används för IM-MS mätningar är märkta i enlighet med deras position i instrumentet. Den jonstrålar är färgad i rött, och trycket i varje region har utsetts med hjälp av en färgkod. Panelen på botten visar på den potential gradient längs instrumentet och eventuella skillnader som definierar Trap och överföring av energier kollision liksom Bias potential. Alla potentialer läsa-backs refereras till Static offsetspänning som vanligtvis är inställd på 120V. Figur 2. Ion rörlighet ankomsttid distributioner för Gβυ protein. A. En hög t-vågen hastighet leder till en smal fördelning av drift tiden profilen. Tomten illustrerar fördelningen ankomsttid för 16 + (röd), 15 + (grön), 14 + (blå), och 13 + (magenta) laddning stater, liksom den totala drift tid profil (i svart) i G βυ protein. B. En optimerad drift tid spektrum med en mjuk Gaussisk topp form. Liknande färgetiketter som i en. C. En "roll-over" effekt som uppstår när den tid det tar för joner att korsa rörlighet cellen är långsammare än intervallet mellan injektioner av nya jon-paket i enheten. Som ett resultat visas den förlängda glida tiden topp i början av spektrumet. Denna effekt kan elimineras genom att öka T-våghöjden, och minskar T-vågen hastighet och IMS tryck. D. konstgjord "krusningar" uppstår när Transfer T-vågen hastighet och påskjutning av frekvens är delvis synkroniserade. Denna effekt kan övervinnas genom att justera antingen pusher frekvens eller Transfer T-våg hastighet. Figur 3. Effekten av jon aktivering och partiell denaturering villkor för IM-MS spektra av hemoglobin. Täppa för avdrift tid jämfört med m / z för tetrameriskt hemoglobin komplex, med en vattenlösning på 10 mm ammoniumacetat (pH = 7,6) (A, C) och tillägg av 0,1% ättiksyra (B). Data som förvärvats med hjälp Trap spänning kollisionsenergi på 13 V (A, B) och 35 V (C) Även i alla tre panelerna masspektrum (projiceras på den översta) ser ut, med en tetrameriskt avgift serie centrerad vid 4000 m / z, drivan tidsprofil (projiceras på sidorna) är annorlunda (total drift tid distributioni svart, och den 16 + profilen är i rött). Ju längre drift tid på delvis denaturerade provet, som erhållits i B, och gasfas aktiveras joner, som erhålls i C, tyder på en viss utbredning. Denna observation visar att även om den uppmätta massan motsvarar en intakt komplex, är dess lösning strukturen störs. Som en konsekvens är noggrann kontroll av experimentella villkor. Figur 4. Genom att generera en kalibreringskurva, drift tid mätningar och kollision tvärsnitt kan korreleras. A. Uppmätta värden glida tiden för flera avgiften delstaterna häst cytokrom C (cirklar), häst hjärtat myoglobin (trianglar) och bovin ubiquitin (torg) var plottas mot litteraturen Ω värden korrigerade för både jon laddningstillstånd och minskad massa. Passformen ger en linjär funktion motsvarande: ln (Ω C) = XLN (t D) + A. De fastställda exponentiell faktor (x), montera bestämd konstant (A) och korrelationskoefficient visas på tomten för data förvärvades till en T-våg hastighet av 350 m / s, och en statisk våghöjd på 11 V. B. Ett histogram av distributioner korrelationskoefficienten från 10 på varandra följande kalibrering experiment. Protein prov / tekniska parametrar GluFibrino- peptid monomer 1,6 kDa Myoglobin monomer 17 kDa Hemoglobin tetramer 67 kDa Transferrin monomer 80 kDa GroEL 14-Mer 801 kDa Säkerhetskopiera tryck, mBar 4,4 5,0 5,1 5,1 6,5 Trap tryck, mBar 1.6×10 -2 2.4×10 -2 2.4×10 -2 2.6×10 -2 2.8×10 -2 IMS Pressure, mbar 4.4×10 -1 4.4×10 -1 4.4×10 -1 4.4×10 -1 4.2×10 -1 Provtagning kon spänning, V 46 80 80 80 118 Extraktion kon spänning, V 1,7 1 1 1 3 Bias spänning, V 20 20 25 25 50 Trap kollision energi, V 20 15 15 15 80 Överför kollision energi, V 5 12 12 12 15 Tabell 1. Försöksbetingelser som används för analys av makromolekyler. Standard Protein Molekylmassa (m) Avgifter (z) m / z Kollision tvärsnitt (i 2) Cytokrom C 12.213 10 1222,3 2226 11 1111,3 2303 12 1018,8 2335 13 940,5 2391 14 873,4 2473 15 815,2 2579 16 764,3 2679 17 719,4 2723 18 679,5 2766 Myoglobin 16.952 11 1542,1 2942 12 1413,7 3044 13 1305,0 3136 14 1211,9 3143 15 1131,1 3230 16 1060,5 3313 17 998,2 3384 18 942,8 3489 19 893,2 3570 20 848,6 3682 21 808,2 3792 22 771,6 3815 Ubiquitin 8565 8 1071,6 1442 8 1071,6 1622 9 952,7 1649 10 857,5 1732 11 779,6 1802 Tabell 2. Kalibreringsvätska proteiner och deras kollision tvärsnitt värden som bestäms med konventionella IMS mätningarna 14. Enheter Företag Katalognummer Synapt HDMS-32K RF generator Vatten AB P-97 Flaming-Brown mikropipetten avdragare Sutter Instrument P-97 Spotta bestrykningsenhet Elektronmikroskopi Sciences EMS550 Binokulärt mikroskop Nikon Reagenser Företag Katalognummer Ammoniumacetat Sigma-Aldrich Sigma, A2706 CsI 99,999% Sigma-Aldrich Aldrich, 203.033 Metanol Sigma-Aldrich Fluka, 34.966 Ättiksyra Fisher Scientific AC12404 Equine myoglobin (från häst hjärtat) Sigma-Aldrich M1882 Equine cytokrom c (från häst hjärtat) Sigma-Aldrich C-2506 Bovin ubiquitin (från röda blodkroppar) Sigma-Aldrich U6253 Hemoglobin Sigma-Aldrich H2625 Gas Kommentarer Kväve, 99,999% ren 8 kubikmeter cylinder Argon, 99,999% ren 8,8 kubikmeter meterscylinder Tabell 3. Reagenser och utrustning.