1. Системная Способы доставки Хотя системной доставки наркотиков не является наиболее эффективным подходом для достижения высокой концентрации препарата в ЦНС, системные поставки удобны и хорошо принимаются пациентами. Здесь мы покажем, надлежащих процедур в течение трех обычно используются системные подходы администрации: внутривенные инъекции, при введении препарата, а также устные желудочный зонд. А. Внутривенные инъекции (инъекции хвостовую вену) Перед началом процедуры, массы тела каждой мыши должны быть зарегистрированы. Как и все доклинические исследования, масса тела должна контролироваться регулярно (дважды в неделю или больше) для оценки потенциальной токсичности препарата. Не более 1% от массы тела мыши в объеме следует вводить за один раз. Например, не более 0,2 мл жидкости должны быть введены в 20g мыши. Все растворы вводят внутривенно следует стерилизовать соответствующий метод. Мыши должны быть прогреты в течение 5-10 минут, используя либо грелку или тепла лампы, чтобы расширить хвостовую вену. При использовании тепла ламп, монитора мыши в любое время, чтобы избежать гипертермии. Мышь переходит к проведению устройство, которое сдерживает мыши, обеспечивая доступ к хвостовой вены (см. видео). В мышке хвост Есть четыре видимых сосудов: сосуды на спинной и боковых сторонах вены, и судно на брюшной стороне артерии. Чтобы получить доступ к хвостовой вены, хвост мыши проводится в наиболее дистальной точке, и поворачивается на 90 градусов так, что вены вверх. Инъекции очищается спиртом и 28 г шприц инсулина вводится, скошенные стороной вверх, в вену (см. видео). Если игла правильно расположенных в вену, он должен двигаться свободно и без давления. Медленно вводить препарат с равномерное давление в течение 5-10 секунд. Если волдырь появляется на хвост, остановить закачку, так как это означает, что игла не в вене. После инъекции применять мягкое давление в месте инъекции до остановки кровотечения. Это обычно занимает 30-60 секунд. Монитор мыши в течение 5-10 минут после инъекции, чтобы гарантировать, что нет никакого дальнейшего кровотечения. Б. внутрибрюшинного введения Перед началом инъекции, препарат должен быть загружен в шприц прилагается к 28g иглы. Убедитесь, что есть место в шприце для рисования поршень до инъекции (например, если инъекционных 200 мкл, убедитесь, что шприц мощностью 300 мкл и выше). Удалить мыши из клетки за хвост и поместите его на текстурированной поверхности, так что мышь имеет некоторое отношение к рукоятке. Клетке крышкой, как правило, достаточно. Разрешить мыши растягивать свое тело, а затем с помощью не доминантной рукой возьмитесь за кожу на спине мыши, заботясь, чтобы слегка ущипнуть, как много кожи возможно между большим и указательным и средним пальцами (см. видео). Включите курсор так, чтобы живот мышь вверх. Если мышь может свободно двигать головой, отпустите сцепление и попробуйте еще раз, чтобы избежать укуса во время инъекции. С Вашей доминирующей рукой, поднимите шприц и вставить иглу в 30 градусов в левом нижнем квадранте мыши (см. видео). Холдинг мыши слегка перевернутой поможет поднять органов от укола. Чтобы убедиться, что игла находится в внутрибрюшинного пространства, потяните на себя поршень шприца. Если какой-либо жидкости или крови появляется в шприц, затем игла не находится в внутрибрюшинного пространства и должна быть удалена. Если нет жидкость всасывается в шприц, а затем вводят шприцем содержимое даже давления на 1-5 секунд и отпустите кнопку мыши. Монитор мыши в течение 5-10 минут после инъекции, чтобы мышь возвращается к нормальному уровню активности. С. Устные зонд Перед началом инъекций, записывать вес мыши. Максимальный объем, который может быть доставлен по устным зонд является 10 мл на килограмм массы тела. Например, максимальный объем для 20g мыши будет 200 мкл. Попытка придать больший объем может привести к рефлюкс, что приведет к неполной доставки лекарств. Если необходимо администрировать объемах, чем указано выше, по меньшей мере три дозы могут быть введены в течение 24 часов. Чтобы избежать проколов пищевода, важно, чтобы измерить длину зонда иглы для каждой мыши. Держите кончик 18g мяч изогнутыми зонд иглы в последние ребра мыши, а затем знак длины на кончике голову мыши, используя маркер (см. видео). Во время принудительного кормления, то этот знак будет точка остановки, как вы вставить иглу в устье мыши. Сдерживайте мыши, используя тот же ручка, как для внутрибрюшинного введения. Вставьте зонд иглу в рот, за язык, и ADVANCE иглу через глотку. Не вставляйте иглу прошлом остановки знака. Игла должна проходить гладко, без какого-либо давления (см. видео). Если вы столкнулись с давлением, остановить и вывести иглу, чтобы избежать инъекционного жидкости в легкие. С иглу на месте, нажмите поршень более 1-5 секунд, а затем удалить иглу под тем же углом, что он вставлен. Монитор мыши в течение 5-10 минут, обращая особое внимание на любые признаки затрудненного дыхания, которые могут указывать, что жидкость вошла легких. 2. Местной Доставки Острый Конвекция-Enhanced доставки А. Зонд Строительство Рефлюкс-устойчивые КНИ канюли для грызунов еще не на коммерческой основе. Здесь мы продемонстрируем метод построения канюля, которая была адаптирована из метода впервые описана Краузе и др. (Краузе 2005). Канюля состоит из трех частей (рис. 1): 100 мкм трубки кремнезема диаметром, через которые инфузата потоков, жесткие иглы металла для структурной поддержки и гибкие трубки Тефлоновые для загрузки инфузата. Чтобы получить жесткую иглу металла, использовать открытый огонь, чтобы расплавить пластик на катетер Surflo IV (24g стилет) и с помощью пинцета удалите металлической иглы. Остальные катетер может быть удален. Сокращение длины трубы кремнезема (OD 0.163mm), немного дольше, чем металлическая игла, с помощью всего одного края лезвия бритвы. Роль кремния труб в небольшую каплю цианоакрилат основан быстродействующий клей (например, Krazy Glue), заботясь, чтобы не получить любой клей на концах трубы. Вставьте кремнезема труб в металлической иглы и дайте высохнуть в течение 5 минут. После высыхания, кремния трубки должны быть прочно прикреплены к игле. Концы кремния должны быть обрезаны так, что 2 мм кремнезема трубки выступает из заостренный конец иглы и 3 мм кремнезема трубки выступает из плоским концом (см. видео). Вырезать часть тефлоновой трубки 20 см в длину. Рулон металлической иглы в небольшую каплю клея, снова стараясь не получить клея на концах трубки кремния, поскольку это будет забивать канюли. Вставьте иглу в трубки Тефлоновые на глубину до 1 см. Дайте высохнуть в течение 1 минуты. Использование клей пистолет, нанесите каплю горячего клея для соединения между иглой металл и трубы тефлон (см. видео). Убедитесь, что все совместные покрыта со всех сторон и дать высохнуть в течение по крайней мере 1 час. Канюли могут быть сделаны до недели заранее и хранить при комнатной температуре. Б. Процедура инфузии Для подготовки хирургической области, все поверхности должны быть распылены с дезинфицирующим средством, например, 2% раствором хлоргексидина. Стерильные хирургические перчатки во время процедуры. Поверхность покрывается абсорбирующего шторы. Следующие поставки должен быть помещен в хирургическое площадь: Грелки для поддержания температуры тела мыши Два маленьких чашках Петри, один, содержащий 3% перекиси водорода, а один, содержащий 2% хлоргексидина Стерильные тампоны марли и хлопка Стерильные одноразовые скальпели (номер 21) Стерильные 22g иглы Мышь стереотаксической кадра Контролируемая скорость насоса шприца Автоклавного кожи мыши степлер, скобы, и основным для удаления Для настройки КНИ канюли, приложите 1 мл шприц, чтобы трубка тефлон с помощью набора пластиковых адаптеров шприц. Канюли должны быть прикреплены к стереотаксической кадр так, чтобы она была перпендикулярна к хирургическому поверхности (см. видео). Для дезинфекции канюли, заполнить шприц 1 мл 70% этанола и нажмите поршень для запуска этанола через канюлю. Повторите этот процесс с помощью стерильного физиологического раствора, и проверить на наличие течи вокруг суставов канюли. Для дезинфекции вне канюли, аккуратно протрите 70% этанола салфеткой. Заполните канюли стерильным физиологическим раствором, а затем потяните на шприц так, чтобы небольшой пузырек воздуха втягивается в канюлю. Этот воздушный пузырь будет отдельный инфузата от физиологического раствора в канюлю. Затем, backload ваш инфузата (см. видео). Подключите шприц насос шприца и премьер-насос, работающий кратко канюли. Седативный мыши, используя инъекции обезболивающего и подготовить кожу моечные несколько раз (в течение 5-10 секунд) с кусочком стерильной марли, смоченной в 2% раствором хлоргексидина. Офтальмология мазь следует наносить на мыши для поддержания адекватного уровня влажности во время процедуры. Используя стерильный скальпель, создать сагиттальный разрез по центру черепа, около 1,5 см длиной (см. видео). Поверхности черепа, затем очистить с помощью ватного тампона, смоченной в 3% раствором перекиси водорода. Будьте осторожны, чтобы избежать попадания перекиси водорода в глазах мыши. Шва линии черепа должно быть очевидно, на данный момент: если они не видны, мягко тампоном череп с фрэш ватный тампон, пропитанный 3% раствором перекиси водорода. Определить брегмы (рис. 2), а затем измеряют 2 мм до 1 мм справа и задний этой структуры, чтобы найти месте инфузии. Использование стерильной иглой 22g, мягко создать отверстие в черепе, в этот момент, повернув иглу против черепа (см. видео). Избегайте воздействия иглой вниз от черепа. На данный момент, мыши должны быть помещены в стереотаксической рамы и начать получать вдыхании анестезии (см. видео). Администрирование анестезии на низком уровне (1%), а также тщательно следить за мышь для изменения в частоте дыхания, регулируя анестезии соответственно. Позиция канюля за череп отверстие и опустите 3 мм ниже поверхности черепа. Начните инфузии, используя следующие ставки и длительности: 0,1 мкл / мин в течение 5 минут 0,2 мкл / мин в течение 5 минут 0,5 мкл / мин в течение 5 минут 0,8 мкл / мин в течение 7,5 минут OFF в течение 1 минуты В конце инфузии, медленно извлеките канюлю и тампоном, череп с 3% перекисью водорода. Применить стерильный воска кости отверстие (см. видео). Использование щипцов, рисовать кожу вместе над черепом и основных закрыть. Бупренорфин следует назначать для послеоперационного обезболивания. Монитор мыши после операции, пока не приходит в сознание и подвижность. Из-за продолжительности процедуры, она может занять до часа для мыши, чтобы восстановить полноценную работу. За это время место мыши клетку на грелку, чтобы избежать переохлаждения, а не дома восстановления мыши с другими активными мышей. Кожа скобы должны быть удалены через неделю после операции. С. В Vivo изображений Флуоресцентно меченных инфузата могут быть отображены следующие КНИ администрации, и может следить за изменениями в интенсивности сигнала, а также сигнал месте. Как правило, лучше подождать 2-3 часа после инфузии на изображение, с тем чтобы мыши, чтобы оправиться от вливания. Для обезболивания во время съемки, используйте низкий уровень вдыхания анестетика. Поместите мышь, спинной стороной вверх, в станцию визуализации (например, ИВИС Lumina, суппорт Life Sciences, Аламеда, штат Калифорния). Использование соответствующего фильтра настройки для фтора, что в настоящее время отображаемого, приобретать изображения. Для КНИ, успешный вливания должны показать большую часть материала в мозге возле месте инфузии (рис. 3). 3. Представитель Результаты Отсутствие побочных реакций на введение терапия является важным показателем успешной инъекции. Например, после инъекции вены хвоста не должно быть никаких изменений внешнего вида (например, размер, цвет) хвост. Пузыря или волдыря следующие хвост инъекции вены будет означать подкожно, а не внутривенно, доставка терапии. Для внутрибрюшинного введения, шишка на коже или обесцвечивание живот может указывать на подкожные инъекции или повреждения внутренних структур. В устной желудочный зонд, мышь с затрудненное дыхание или кашель могут свидетельствовать, что жидкость вводили в легкие, а не в желудке. Для КНИ, неврологических функций важно для оценки успешное управление терапии. Мышь, которая проявляет судороги или гемипарез, возможно, получили неправильное инфузии. Если флуоресцентные инфузата используется, в естественных изображений может быть применена для оценки успешного управления (рис. 3). Если инфузата не локализуется в месте инъекции, инфузии не увенчалась успехом. Рисунок 1: CED канюля и хирургической установки. Основными элементами конвекции-повысить результативность хирургической настройки отображаются. Microinfusion насоса () прилагается к инфузии канюля (Б, как показано увеличены на вершине). Стереотаксической рамы (C) используется для позиционирования зонда. Этот образ не включают отопление и анестезиологическое оборудование также используется во время процедуры. Рисунок 2: Мышь Линии черепа швов. КНИ сайт инфузии (красная звезда) могут быть расположены путем выявления пересечения сагиттальной и корональной швов (брегмы), а затем измерения 2 мм боковой и задней 1 мм в темя. Рисунок 3: Представитель Результаты успешного КНИ. Liposomes помечены дальнего красного флуоресцентного красителя вводились в мозг мыши по КНИ и отображаемого как в естественных условиях и бывших естественных условиях. Успешное вливание показывает, флуоресцентный сигнал локализован в месте инфузии, как в естественных условиях (А) и экс естественных условиях (B). Сигнал должен быть локализован в инфузии полушарии, не допуская утечки в контралатерального полушария. Рисунок 4: представитель Изображение успешных КНИ в Крыса мозга. Флуоресцентно меченных липосом были проникнуты в крысу мозга. У крыс, столько, сколько 20 мкл могут вводиться. Увеличилась толщина черепа крысы и глубину инъекции исключается в естественных изображений, но и правильное расположение вливания могут быть проверены, бывшим визуализации естественных условиях из расчлененного мозга.