Summary
هذا البروتوكول يصف النهج العام لأداء photoconversion من البروتينات الفلورية على مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر. نحن تصف إجراءات photoconversion عينات البروتين puried ، فضلا عن ثنائي التحقيق تسليط الضوء على الخلايا الضوئية في العيش مع وmOrange2 Dronpa.
Abstract
البروتينات الفلورية Photoconvertible (PC - FPS) هي فئة من البروتينات الفلورية مع "هيغليغتر البصرية" القدرة ، وهذا يعني أنه يمكن تغيير لون ومضان عن التعرض لضوء طول موجة محددة. تسليط الضوء على العلامات الضوئية يسمح موسع بعض الفئات السكانية من الجزيئات نيون ، وبالتالي فهي مثالية لتعقب خلايا مفردة أو العضيات.
المعلمات حرجة للphotoconversion كفاءة وكثافة ومدة التعرض للضوء photoconversion. إذا كانت كثافة منخفضة جدا ، وسوف يكون بطيئا photoconversion أو لا يحدث على الإطلاق. من ناحية أخرى ، يمكن أن كثافة أكثر من اللازم أو التعرض لفترة طويلة جدا photobleach البروتين وبالتالي الحد من كفاءة photoconversion.
يصف هذا البروتوكول نهجا عاما كيفية إعداد ليزر متحد البؤر المجهر لفحص الطلبات photoconversion PC - FP. أولا ، نحن وصف الإجراء لإعداد عينات الحبرية تنقية البروتين. هذا التنسيق هو نموذج مناسب جدا لدراسة السلوك photophysical من البروتينات الفلورية تحت المجهر. ثانيا ، سوف نستخدم عينة بروتين الحبرية لإظهار كيفية تكوين المجهر لphotoconversion. وأخيرا ، فإننا سوف تظهر كيفية تنفيذ الضوئية في تسليط الضوء على الخلايا الحية ، بما في ذلك التحقيق تسليط الضوء المزدوجة البصرية مع mOrange2 وDronpa.
Protocol
1. إعداد عينات الحبرية بروتين فلوري
قطرات بروتين فلوري عينة تتكون من مستحلب 1-octanol/water مع بروتين فلوري المقيمين في المرحلة المياه. وتأتي هذه مستحلب بين شريحة المجهر والزجاج مربعة طول ضلعها 22 غطاء لتطبيقات المجهر.
- قبل اتخاذ الفلورسنت عينات الحبرية البروتين الشرائح المجهر والنظارات تغطية الحاجة إلى تنظيف والمغلفة مع وكيل مسعور.
- تنظيف الأواني الزجاجية التي الغسيل 5 دقائق مع الأسيتون ويترك ليجف عن طريق الجو. (اختياريا ، بعد تنظيف الأواني الزجاجية ويمكن علاج لمدة 30 ثانية في نظافة البلازما للحصول على النتائج المثلى طلاء).
- يعد حل 2 ٪ methyltrimethoxysilane في الأسيتون ومعطف الأواني الزجاجية اثناء حضانة 2 دقيقة في هذا الحل. بعد طلاء إزالة الزجاج من المحلول ويترك ليجف عن طريق الجو. ثم شطف مع الايثانول 70 ٪ من زجاجة رذاذ ويترك ليجف مرة أخرى. (اختياري ، يمكن في هذه المرحلة يكون خبز والأواني الزجاجية لمدة 1 ساعة على 80 درجة مئوية لربط تساهمي في طلاء الأواني الزجاجية ل). ويمكن تخزين الأواني المطلية لا يقل عن شهر واحد.
- ويجري تنقية البروتينات الفلورية والبروتين له 6 - الموسومة من E. 1 القولونية. قياس الطيف الامتصاصية من البروتين النقي وإعداد الأوراق المالية مع تخفيف الكثافة البصرية ~ 0.1 في STE العازلة (150 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي تريس ، الرقم الهيدروجيني حمض الهيدروكلوريك 8 ، 1 ملم EDTA) ، التي تحتوي على 0.1 ٪ ألبومين المصل البقري (BSA) . بالإضافة تحضير 10 مل من مزيج 01:01 من العازلة 1 - الأوكتانول وSTE في أنبوب مخروطي 15 مل ومزيج بقوة. بعد إجازة الاختلاط حتى فصل المرحلة بشكل كامل. المرحلة الأعلى هو 1 - الأوكتانول. (تنبيه : 1 - الأوكتانول لأن له رائحة قوية من المهم استخدام حاوية النفايات المغلقة على كل شيء يأتي في اتصال مع الأوكتانول - 1).
- لجعل ماصة مستحلب 45 ميكرولتر 1 - الأوكتانول و 5 بروتين فلوري ميكرولتر في أنبوب microfuge. اضغط على أنبوب بضع مرات بإصبعك لبدء تشكيل مستحلب ثم يصوتن الأنبوب لمدة 30 ثانية في حمام صوتنة. في الوقت نفسه الحصول على شريحة المجهر والزجاج المطلي وتغطية جاهزة. بعد صوتنة ينبغي أن يكون مستحلب غائم تماما. مباشرة بعد صوتنة مستحلب 4 ماصة ميكرولتر من منتصف الأنبوب على شريحة المجهر وتغطية المغلفة مع كوب تغطية المغلفة.
- إذا تم إجراء بشكل صحيح يجب أن مستحلب انتشار بالتساوي بين الشريحة المجهر والزجاج الكائن. في غضون دقائق وينبغي أن تكون العينة مستقرة ، ويتألف من 10 ميكرون ~ قطرات الفلورسنت سميكة بدرجات القطر. أكبر قطرات على مقربة من مركز للعينة وتقع أصغر مزيد من التقدم نحو الحواف.
2. إقامة تجربة photoconversion
الإجراء التالي هو استراتيجية عامة لإقامة photoconversion بروتين فلوري التجربة. ويمكن تطبيق هذا الإجراء لتنقية البروتينات فضلا عن الخلايا الحية.
- المعلمات التالية يوفر نقطة انطلاق العامة لإعداد تجربتك photoconversion :
40X الغمر النفط 1.3NA الهدف
حجم الصورة = 512 × 512 بكسل
مسح التكبير = 4
بكسل يسكن الوقت = 6 μsec.
Z - القرار (حجم الثقب) = 3 ميكرومتر - تكوين قنوات كشف اثنان لمضان الأولية وphotoconverted ، فضلا عن "قناة photoconversion". في هذا المثال سوف نستخدم المنقى mOrange2 البروتين ، وهو البرتقالي إلى الأحمر بروتين فلوري photoconvertible. يتم الكشف عن أنواع البرتقال باستخدام 561 نانومتر ، والإثارة التي يتم جمعها في مضان بين 570 نانومتر و 630 نانومتر. تم الكشف عن هذا النوع photoconverted الحمراء باستخدام 633 نانومتر ، والإثارة التي يتم جمعها في مضان بين 640 نانومتر ونانومتر 700. ل "قناة photoconversion" حدد 488 نانومتر الإثارة وجمع مضان بين 490 نانومتر ونانومتر 540. (ملاحظة : التصوير القناة photoconversion ليس ضروريا تماما)
- استخدام القناة لتصوير مضان الأولي مع المسح المستمر لضبط السلطة وكسب ليزر للكشف عن جودة الصورة المثلى.
- تنشيط قناة photoconversion وحدد قوة الليزر المنخفضة. بدء تصوير سلسلة مرور الوقت وزيادة تدريجية ليزر photoconversion حتى يتم تبييض وحظ كبير من مضان الأولي. تواصل المسح حتى مضان الأولي هو ما يقرب من 75 ٪ ابيض.
- تنشيط وتفعيل قناة photoconversion القناة الكشف عن photoconverted مضان. بدء التصوير مع مكسب للكشف عن ارتفاع وانخفاض قوة الليزر وزيادة قوة الليزر تدريجيا حتى يتم الكشف عن photoconverted مضان. بمجرد الكشف عن مضان photoconverted يمكنك ضبط قوة الليزر لكشف والحصول على جودة الصورة المثلى.
- أخيرا ، استخدمت قوة الليزرلphotoconversion فضلا عن مدة photoconversion بحاجة إلى أن يكون الأمثل. وزيادة قوة الليزر photoconversion تسريع معدل photoconversion ، ولكن الكثير من قوة الليزر سوف photobleach البروتين.
- مرة واحدة وقد تم تحديد الليزر photoconversion الأمثل السلطة ومدتها ، ويمكن استخدام هذه المعلمات لتكوين وحدة معيارية أو photobleaching FRAP و "قناة photoconversion" لم تعد مطلوبة.
3. المزدوج التحقيق تسليط الضوء على والبصرية مع mOrange2 Dronpa
لأن من خصائص الحمراء تحولت الطيفية ، يمكن أن تستخدم في تركيبة مع mOrange2 الأخضر photoswitchable Dronpa بروتين فلوري لتسليط الضوء على التحقيق المزدوجة البصرية للسماح الانتقائي لتسليط الضوء على خلية مفردة 4 (عضية) السكان.
- تزرع الخلايا في أسفل الزجاج والأطباق ماتيك transfected قبل 24 ساعة من التصوير باستخدام معيار Lipofectamine2000 ترنسفكأيشن 1.
- إعداد المجهر لmOrange2 photoconversion كما هو موضح في القسم 2.
- تكوين لphotoswitching Dronpa المجهر. ولا يمكن تصوير Dronpa مضان باستخدام mOrange2 "قناة photoconversion" (انظر الخطوة 2.2). (ملاحظة : تصغير قوة الليزر المستخدمة في التصوير Dronpa ، لأن الكثير من الطاقة ليزر لتعطيل سيتسبب Dronpa.) إضافة إلى قناة لتنشيط ضوئي Dronpa. نحن نستخدم 800 نانومتر ثنائية الفوتون الإثارة لتنشيط ضوئي ، ولكن بدلا من ذلك يمكن أن يتحقق ذلك باستخدام الإثارة 405 نانومتر. تحديد الطاقة المطلوبة ليزر والتصوير ، وتنشيط ضوئي ، وتعطيل ضوئي من Dronpa مضان.
- الحذر : Photoconversion من mOrange2 وتعطيل كلا من Dronpa تحدث عند الإثارة نانومتر 488. نظرا لقوة الليزر العالية المطلوبة لmOrange2 photoconversion هذا سوف يعطل أيضا Dronpa مضان. من ناحية أخرى ، Dronpa تعطيل يحدث بالفعل في قوة الليزر أقل من ذلك بكثير ، ويمكن القيام بها دون photoconversion mOrange2 كبيرة.
- حالما يتم تعيين المعلمات لphotoconversion mOrange2 وphotoswitching Dronpa ، هو تسليط الضوء على تحقيقه من خلال التحقيق المزدوجة البصرية الخطوات التالية. أولا ، تعطيل Dronpa مضان في مجال كامل من العرض مع انخفاض القوة الإثارة نانومتر 488. ثانيا ، تحديد منطقة من الاهتمام وmOrange2 photoconvert الإثارة مع ارتفاع الطاقة نانومتر 488. أخيرا ، حدد المنطقة التي تهم تنشيط Dronpa مضان.
4. ممثل النتائج
الشكل 1. قطيرة إعداد العينة. A) عينة الحبرية أعدت بشكل صحيح. ب) نموذج أعدت طلاء دون الشريحة المجهر والزجاج غطاء. ج) إعداد نموذج دون إضافة BSA 0.1 ٪.
الشكل 2. وphotoconverted باستمرار تأثير قوة الليزر photoconversion ومدتها على mOrange2 photoconversion. قطرات واحدة تحتوي على البروتين mOrange2 باستخدام كميات مختلفة من 488 نانومتر قوة الليزر. وكان النسبي لقوة الليزر المستخدمة photoconversion 10 ٪ (الصلبة) ، و 25 ٪ (متقطع) ، و 100 ٪ (منقط). أ) أنواع البرتقال الفلورسنت. B) Photoconverted الأنواع الحمراء الفلورسنت.
الشكل 3. المزدوج التحقيق تسليط الضوء على والبصرية مع mOrange2 Dronpa. خلية) معربا عن mOrange2 - هيستون H2B وDronpa ميتو - photoconversion قبل ، والتي تبين البرتقال مضان في النواة ومضان أخضر في الميتوكوندريا. ب) تم تبديل Dronpa مضان قبالة مع انخفاض القوة الإثارة 488 نانومتر ، مما تسبب في الحد الأدنى من photoconversion mOrange2. C) كان photoconverted mOrange2 إلى اللون الأحمر مع ارتفاع القوة الإثارة نانومتر 488. D) وتحولت Dronpa مضان على مرة أخرى باستخدام 800 نانومتر 2 - الفوتون الإثارة. لوحات وتراكب من الصور مضان جنبا إلى جنب مع فرق التدخل تباين الصورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتنقيته قطيرة عينة بروتين فلوري هو تنسيق عينة مريحة للغاية لتوصيف البروتينات الفلورية photophysical ، على سبيل المثال لدراسة حركية وحركية photobleaching photoconversion. حجم القطيرات الصغيرة جدا (~ 20 بيكو لتر) يسهل photobleaching photoconversion والتجارب ، والتي قد يكون من الصعب القيام بها في النظم القائمة كفيت. بالإضافة إلى ذلك ، كما هو موضح هنا هو نموذج مثالي للالحبرية لإقامة المجهر مبائر photoconversion للتطبيقات. طلاء مسعور ووجود جيش صرب البوسنة وهامة للحصول على قطرات متجانسة. بدون طلاء قطرات تميل الى ان تكون ممرود ضد واحدة من الواجهات الزجاجية وفي غياب جيش صرب البوسنة بروتين فلوري تتراكم في واجهة 1-octanol/water ، وخلق هالة من مضان (الشكل 1).
غالبا ما يعتبر بروتين فلوري photoconversion كبديل للانتعاش بعد مضان photobleaching (FRAP) ، مع ميزة أنه يمكن للمرء أيضا اتباع photoconverted الأنواع. ومع ذلك ، فإنه من المهم أن نعتبر أن photoconversion اعتمادا كبيرا على قوة الليزر المستخدمة. أيضا سوف بكثير قوة الليزر photoconversion أو التعرض طويلا يسبب photobleaching بدلا من photoconversion ، مما يقلل من كمية مضان photoconverted (الشكل 2).
الخصائص الطيفية الحمراء تحولت من mOrange2 والانواع photoconverted تصريح مزدوج التحقيق تسليط الضوء البصرية مع هيغليغتر الضوئية الخضراء الفلورسنت. وهذا يمكن أن يكون إما بروتين فلوري photoswitchable (Dronpa) ، كما أظهر هنا ، أو بدلا من ذلك البروتين photoactivatable الفلورسنت ، على سبيل المثال PA - GFP. Dronpa لديه ميزة أنه يمكن لأحد أن تحقق وجودها في بداية التجربة. من ناحية أخرى ، فإن استخدام Dronpa يعقد إبراز البصرية ، لأن كل مضان Dronpa المعطل يجب أن يكون أولا ، وحقيقة أن تحولت تدريجيا Dronpa مضان قبالة أثناء التصوير هذه المضاعفات هي أقل عمقا عند استخدام PA - GFP ، ولكن التحقق من وجود السلطة الفلسطينية وقبل GFP تنشيط ضوئي يمكن أن يكون أكثر صعوبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر مايك ديفيدسون جورج (جامعة ولاية فلوريدا) لتقديم الحمض النووي بلازميد ترميز البروتينات الفلورية. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM72048 (لبرنامج عمل الدوحة).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microsope slides | VWR international | 48312-003 | |
| 22 mm cover glass | Corning | 2940-245 | |
| 1-octanol | Sigma-Aldrich | O4500 | |
| methyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich | M6420 | |
| MatTek dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 |
References
- Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 6, 355-358 (2009).
