लाइव कक्ष में प्रतिदीप्त प्रोटीन और दोहरी जांच ऑप्टिकल प्रकाश डालते शुद्ध के Photoconversion
Summary
इस प्रोटोकॉल के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन के photoconversion एक लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग पर प्रदर्शन के लिए एक सामान्य दृष्टिकोण का वर्णन करता है. हम puried प्रोटीन के नमूने के photoconversion, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से mOrange2 और Dronpa के साथ जीवित कोशिकाओं में दोहरी जांच ऑप्टिकल हाइलाइटिंग के लिए के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन.
Abstract
Photoconvertible फ्लोरोसेंट प्रोटीन (पीसी fps) "ऑप्टिकल हाइलाइटर" क्षमता के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन के एक वर्ग, जिसका अर्थ है कि प्रतिदीप्ति के रंग एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के प्रकाश के संपर्क में द्वारा बदला जा सकता हैं. ऑप्टिकल हाइलाइटिंग noninvasive फ्लोरोसेंट अणु के एक subpopulation के अंकन की अनुमति देता है, और इसलिए एकल कक्षों या organelles पर नज़र रखने के लिए आदर्श है.
कुशल photoconversion लिए गंभीर मापदंडों photoconversion प्रकाश की तीव्रता और जोखिम समय कर रहे हैं. यदि तीव्रता बहुत कम है, photoconversion या सभी में होते धीमा नहीं किया जाएगा. दूसरी ओर, तीव्रता बहुत ज्यादा या बहुत लंबे समय जोखिम प्रोटीन photobleach और जिससे photoconversion की दक्षता को कम कर सकते हैं.
यह एक सामान्य दृष्टिकोण कैसे करने के लिए पीसी एफपी photoconversion अनुप्रयोगों के लिए लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग सेट प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. सबसे पहले, हम शुद्ध प्रोटीन छोटी बूंद नमूने तैयार करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. यह नमूना स्वरूप फ्लोरोसेंट प्रोटीन की खुर्दबीन के नीचे photophysical व्यवहार का अध्ययन करने के लिए बहुत सुविधाजनक है. दूसरा, हम प्रोटीन छोटी बूंद नमूना उपयोग करने के लिए दिखाने के लिए कैसे photoconversion के लिए माइक्रोस्कोप कॉन्फ़िगर करने के लिए होगा. और अंत में, हम दिखा देंगे कि कैसे mOrange2 और Dronpa के साथ दोहरी जांच ऑप्टिकल हाइलाइटिंग सहित जीवित कोशिकाओं में ऑप्टिकल हाइलाइटिंग प्रदर्शन करने के लिए.
Protocol
Discussion
शुद्ध फ्लोरोसेंट प्रोटीन छोटी बूंद नमूना फ्लोरोसेंट प्रोटीन की photophysical लक्षण वर्णन के लिए एक बहुत ही सुविधाजनक नमूना स्वरूप कैनेटीक्स और photoconversion कैनेटीक्स photobleaching अध्ययन करने के लिए उदाहरण के लिए, है. अत्य?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्लाज्मिड डीएनए एन्कोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रदान करने के लिए धन्यवाद माइक डब्ल्यू डेविडसन (फ्लोरिडा स्टेट यूनिवर्सिटी). यह काम स्वास्थ्य अनुदान GM72048 (DWP के लिए) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Microsope slides | VWR Scientific | 48312-003 | ||
| 22 mm cover glass | Corning | 2940-245 | ||
| 1-octanol | Sigma | O4500 | ||
| methyltrimethoxysilane | Sigma | M6420 | ||
| MatTek dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | ||
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 |
References
- Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 6, 355-358 (2009).
